药用植物马蔺的内生真菌分离及其抑菌活性的研究

[目的]研究药用植物马蔺内生真菌资源的多样性及其抑菌活性特征。[方法]通过组织块法对内生真菌进行分离,并选择小麦全蚀病菌、枸杞黑果病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌和黄瓜立枯病菌5种植物病原真菌和枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌4种细菌作为指示菌,采用对峙法和改进的菌块法测定抑菌活性。[结果]从马蔺不同组织器官中分离出32株内生真菌,以根部的最多,茎叶次之;经形态学初步分类鉴定其属于3个目,3个科,4个属。其中,有22株内生真菌对2种或2种以上的植物病原真菌指示菌有不同程度的抑制作用,占菌株总数的68.8%;有12株内生真菌对2种或2种以上的供试细菌指示菌具有不同程度的抑制作用,占分离菌株总数的37.5%;有7株内生真菌对3种以上的植物病原真菌指示菌具有明显的抑制作用,占菌株总数的21.9%;有2株内生真菌对2种供试细菌指示菌有明显的抑制作用,占分离菌株总数的6.3%。马蔺内生真菌对供试植物病原真菌指示菌和供试细菌指示菌有明显抑制作用,且抑制植物病原真菌的范围较宽;2株高活性菌株来源于马蔺叶部,对5种供试真菌指示菌具有明显抑制作用;2株高活性菌株来源于马蔺根部,对2种供试细菌指示菌具有明显抑制作用;1株高活性菌株对4种供试真菌指示菌和1种供试细菌指示菌有明显抑制作用。这5株高活性内生真菌菌株属于束丝菌属、镰孢霉属、梭孢霉属和组丝核菌属。[结论]药用植物马蔺具有丰富的内生真菌资源,并具有明显的抑菌活性。     

北极海洋沉积物可培养细菌多样性及抗植物病原真菌活性菌株筛选

根据菌落形态特征,从中国第4次北极科考采取的海洋沉积物BN05中分离到19株细菌,对其进行分子鉴定与系统发育分析,并利用平板扩散法从中筛选出对植物病原真菌尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)具有明显抑制作用的活性菌株。分子鉴定与系统发育分析表明,从北极海洋沉积物中分离到的细菌主要为γ-变形杆菌纲(γ-Proteobacteria),分别属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter);1株属于放线菌门(Actinobacteria)的节杆菌属(Arthrobacter)。假交替单胞菌属是北极海洋沉积物BN05中可培养细菌中的优势菌群。活性菌株筛选结果表明,5株菌株对尖刀镰孢菌具有明显的抑制作用,其中菌株BN05-S-2和BN05-B-6属于假单胞菌属,菌株BN05-M-2、BN05-M-7和BN05-B-2属于假交替单胞菌属。     

抗核盘菌海洋放线菌的分离筛选及其抗菌作用测定

从连云港海域采集海水、海泥、漂浮物、海洋动物及海洋植物样品,分离得到47株海洋放线菌,采用平板对峙培养法和打孔法测定放线菌不同菌株及其发酵液对土传植物病原真菌核盘菌的菌丝生长和菌核萌发的抑制作用,以玉米小斑病菌、玉米圆斑病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、雪腐镰刀病菌、斑点落叶病菌、小麦根腐病菌、细链格孢病菌、番茄早疫病菌等植物病原真菌为受试菌,测定不同放线菌菌株的抑制谱.结果表明,放线菌菌株BM-2、T-6、T-1-1、D-3、XS-X5-3、MH-7和XL-7对核盘菌的菌丝生长和菌核的萌发具有较强的抑制作用,同时对供试的9种植物病原真菌具有明显的抑制作用,其中以BM-2菌株的抑菌作用最强,具有较好的研究开发应用前景.     

链霉菌SR-11抑菌活性物质的理化性质初步研究

从四川各县姜土土壤中分离得到1株放线菌SR-11菌株,经初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces).该菌株对姜瘟青枯假单孢杆菌及11种供试菌(其中包括3种病原细菌和8种病原真菌)都有较强抑制作用.对SR-11菌株发酵液的粗分条件和拮抗物粗品的性质进行了研究,结果表明,以体积比为1∶1的乙酸乙酯萃取活性物质最为可行,所得的橙黄色活性粗提物,在37～100℃,pH值3～11处理10～30 min以及胰蛋白酶和蛋白酶K处理1 h后,对青枯假单孢杆菌的抑菌活性不变,说明该物质对热、酸、碱及酶的稳定性强.粗品在官能团反应中,茚三酮反应呈阳性,坂口反应呈阴性,与新霉素的反应结果一致而与链霉素的反应结果相反,说明该物质不是链霉素而可能是新霉素.     

4株海洋真菌发酵液对植物病原真菌的作用

为筛选对植物病害有较好抑制作用的拮抗菌,采用菌落生长法、孢子萌发抑制法和纸碟法测定了从东海岛沿岸海水中分离筛选到的4株海洋真菌的发酵液以及抗菌活性物质粗提物对7种植物病原真菌的抑制作用。结果显示,4株海洋真菌发酵液对7种植物病原真菌的生长有抑制作用,其中菌株179的抑菌效果最好,平均抑菌率达到70．6％;4株海洋真菌的发酵液对兰花炭疽菌2—2和弯孢菌的分生孢子萌发抑菌率均超过96％,特别是菌株152对盘多毛孢菌分生孢子萌发抑菌率达到100．0％;菌株132和152的抗菌活性物质粗提物对镰刀菌,以及菌株179和182对兰花炭疽菌2—2的抑菌效果较好,抑菌带宽分别为15．8、23．3、15．8和16,7mm。试验结果表明,这4株海洋真菌对7种病原真菌具有较好的拮抗作用,有开发利用价值。     

葡萄内生细菌HB135的鉴定及抑菌物质初探

从健康葡萄植株中分离得到157株内生细菌,筛选出对葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)具有抑制作用的8株,其中HB135菌株对葡萄霜霉病防治效果最好,防效达91.27%。抑菌谱试验表明:该菌株对10种供试病原真菌均具有较好的抑制作用,抑菌带宽度为5.37~17.13mm。经形态学观察、生理生化测试及16S r DNA序列同源性分析,鉴定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。该菌株能产生蛋白酶、噬铁素以及挥发性抑菌物质。     

武汉蔬菜市场大白菜软腐病新病原菌鉴定

在大白菜贮藏和运输期间极易受真菌、细菌等微生物侵染而导致软腐病,鉴定软腐病的病原菌是防治大白菜软腐病的重要前提。对武汉市洪山区白沙洲蔬菜市场大白菜软腐病进行病原鉴定。从大白菜软腐病病部分离并培养病原物,并进行形态观察、生理生化鉴定、回接试验、致病性试验及基因测序。结果表明,大白菜软腐病的病原菌菌株S3菌落为灰白色,圆形,中部稍隆起,边缘呈半透明状;菌体为杆菌,革兰氏阴性菌;不产酸,不能分解色氨酸、产生吲哚,甲基红(M.R.)试验为阴性,乙酰甲基甲醇(V.P.)试验为阴性,不产H_2S,容易从伤口侵入。与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌的16S rDNA序列的一致性为99.40%,说明该病原为假单胞菌属。     

拮抗放线菌F1发酵液抑菌谱及稳定性分析

对拮抗放线菌菌株F1发酵液的抑菌谱及稳定性做了研究。抑菌活性实验表明:菌株F1发酵液对供试17种植物病原真菌和7种病原细菌都有较强的抑制活性,在供试的植物病原真菌中,对番茄灰霉病菌和李干腐病菌的抑制作用最强,抑菌圈直径分别为41.04mm和40.12mm;病原细菌中,对丁香假单胞菌流泪致病变种的抑制作用最强,抑菌圈直径可达22.15mm;稳定性实验结果表明:菌株F1发酵液对紫外线、热和酸碱较稳定,在pH为6～10条件下,均能保持较强的抑菌活性,但不耐强酸、强碱;当温度低于60℃时,处理30min和60min,抑菌活性几乎没变化,仍能保持较强的抑菌效果,但高于80℃时,抑菌活性明显降低。表明该菌株发酵液具有广谱抑菌活性和较强的稳定性,具有一定开发价值。     

抗真菌海洋放线菌的分离筛选与抗菌机制研究

从江苏连云港海域采集海水、海泥、漂浮物、海洋动物样品,分离得到15株海洋放线菌.采用平板对峙培养法和打孔法测定放线菌不同菌株对玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)、玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)、雪腐镰刀病菌(Fusarium nivale)、斑点落叶病菌(Alternaria alternata)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、细链格孢病菌(Alternaria tenuis)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)等植物病原真菌的抑制作用.结果表明:放线菌菌株BM-2、T-6、T-1-1、D-3、XS-X5-3、M-7、X-7对供试的植物病原真菌具有一定的抑制作用.其中BM-2菌株的抑菌作用最强,其发酵液能明显抑制多种植物病原真菌菌丝的生长,同时对细链格孢菌的分生孢子萌发和芽管伸长都有一定的抑制作用.     

鱼塘底泥中紫色非硫细菌的分离及鉴定

为了解鱼塘污泥中光合细菌的类群分布,利用特异性培养基对采自周口地区鱼塘的泥水样品进行富集、分离和纯化,得到4株紫色非硫细菌(PNSB)。根据菌落及菌体形态学观察、活细胞吸收光谱测定、碳源和生长因子利用等生理生化试验,确定PSB-1和PSB-4菌株属于红假单胞菌属中的沼泽红假单胞菌,PSB-2菌株属于红假单胞菌属中的荚膜红假单胞菌,PSB-3菌株属于红细菌属中的万尼氏红微菌。研究表明,鱼塘污泥中广泛存在紫色非硫细菌类群。     

抗植物病原真菌海洋细菌的抗菌作用研究

利用植物病原真菌雪腐镰刀病菌(Fusarium nivale)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、玉米小斑病菌(Biploaria maydis)、玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、细链格孢菌(Alternaria tenuis)、小麦根腐霉病菌(Biploaris sorokiniana)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)和斑点落叶病菌(Alternaria alternata)作为指示菌,采用平板对峙法测定海洋细菌的抑菌作用,用打孔法测定海洋细菌的无菌发酵液对指示菌菌丝生长的抑制作用.结果表明:海洋细菌及其发酵液对供试的植物病原真菌具有较强的抗菌作用;显微观察结果表明海洋细菌导致病原真菌菌丝扭曲、分生孢子芽管畸形.其中菌株L1-9对植物病原真菌生长的抑制作用最强,对9种植物病原真菌都有较强的抑制作用.     

草莓根腐病菌拮抗细菌的分离与筛选

为了筛选对草莓根腐病具有拮抗作用的细菌,本试验采用土壤稀释分离法、对峙培养法等方法。从昌平区兴寿镇草莓基地采集的16份土样中分离得到106株细菌。以草莓根腐病菌为靶标,筛选出7株具有明显拮抗作用的菌株,其中1-9和8-3菌株抑菌范围较广,对3种草莓根腐病菌具有抑制作用;2-4菌株对草莓根腐病菌的抑菌范围最窄,仅对1种草莓根腐病菌有抑制作用。对其他供试植物病原真菌抑菌谱测定得知,1-9,12-4,16-1等菌株抑菌范围较广,对供试的7种以上的植物病原真菌均有抑制作用。拮抗细菌生物膜和代谢产物检测结果表明,7株拮抗细菌都能产生生物膜和吲哚乙酸,推测这些菌株具有较强的定植能力和促生效果。     

3株抗植物病原真菌的海洋细菌的分离筛选

从连云港附近海域及市场采集的褐藻、绿藻、虾、三疣梭子蟹、日本鲟、文蛤以及海水和海泥等150个样品,分离到海洋细菌385株。采用平板对峙法测定了分离到的海洋细菌对辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)、玉米斑枯病菌(Septario zeicola)、玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum)、小麦赤腐霉病菌(Fusarium graminearum)、镰刀菌(Fusariumspp.)、雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)、枯萎病原菌(Fusarium oxysporum)、链格孢菌(Alternariasp.)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)10种植物病原真菌的抑制作用,从中获得具抑菌作用的细菌3株,分别是分离自连岛死鱼样品的L1-9菌株、黄窝漂浮枯草样品的HW1-2菌株和分离自西墅虹益蛏样品的XS1-4菌株。菌株L1-9对10种植物病原真菌都有明显的抑制作用,对小麦赤腐霉病菌(Fusarium graminearum)的抑制作用最为明显。采用滤纸片培养法测定的结果表明:3个菌株发酵液对供试的植物病原真菌也有一定的抑菌作用,但抑菌作用低于菌株的直接作用。     

青藏高原矮火绒草内生细菌多样性及生物功能分析

[目的]探究矮火绒草(Leontopodium nanum)内生细菌的群落结构多样性及其生物学功能,为开发相应功能的生物菌剂提供参考,并为青藏高原生态农牧业生产提供有价值的内生细菌资源.[方法]采用组织分离法对矮火绒草植株内生细菌进行分离纯化,基于16S rDNA序列分析确定分离菌株的系统发育地位;通过平板对峙法检测分离菌株拮抗病原真菌活性;检测分离菌株的产吲哚乙酸(IAA)、溶磷和固氮能力;测定分离菌株除草活性、低温适生性及促种子萌发特性.[结果]从矮火绒草植株根、茎、叶和种子部位共分离获得52株内生细菌,基于16S rDNA序列分析发现52株菌株可归属于4门7纲10目14科18属.其中假单胞菌属细菌为根部优势属,约占根部细菌总数的52.17%;茎中以芽孢杆菌为优势属,约占茎部细菌总数的41.18%;各部位的内生细菌数量分布表现为根>茎>种子>叶.在52株内生细菌中,11株有拮抗病原真菌能力、9株具有产IAA能力、7株有溶磷活性、7株具有固氮活性、20株具有除草活性、13株具有耐低温能力和8株具有促生作用;从植株部位分布来看,7种类型的功能菌在根、茎和种子部位均有分布,拮抗菌和除草菌在根部所占的比例较高,溶磷菌株在各植株部位所占比例均较低;在叶中未分离到拮抗菌、产IAA菌、固氮菌和促生菌.各功能菌株分布在17个属,多样性较高,其中假单胞菌属和芽孢杆菌属中含有多种功能菌株,在植株4个部位所占比例也较高.[结论]矮火绒草植株不同部位内生细菌的数量分布具有差异性,但均可分离到不同类型的功能菌株,功能菌株涵盖17个属,其中以假单胞菌属和芽孢杆菌属居多.     

海洋源拮抗细菌对水稻纹枯病的防治

从连云港海域的海水和海泥中分离海洋细菌,以水稻纹枯病菌为指示菌对分离到的海洋细菌的抑菌活性进行检测,经过初筛、纯化、定量复筛,获得11株抑菌效果较好的海洋细菌.采用室内抑菌法测定了这11个活性菌株对8种植物病原真菌的抑制效果,结果表明,菌株MG-sm-3、PY-sw-1、PY-sw-9和Ns-sw-6的抑菌谱广且抑菌活性强.用硫酸铵沉淀法提取了这11个活性菌株的胞外粗蛋白,平板抑菌试验结果表明,菌株PY-sw-1的胞外粗蛋白对7种病原真菌的菌丝生长均有抑制效果,尤其对云薹链格孢(Alternaria brassicae)、灰梨孢(Pyricularia grisea)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)有显著抑制作用.田间试验结果表明,菌株PY-sw-1及其胞外物质对水稻纹枯病的防治效果最好,喷施后7 d的防效分别为63.2%和53.9%.以上试验结果说明一些海洋源微生物对植物病害的防治具有一定的功效.     

放线菌H50发酵液抑菌活性及其稳定性测定

将沈阳农业大学微生物研究室分离的1株放线菌H50[链霉菌属(Streptomyces)]分别以植物病原菌真菌12株、细菌3株为供试菌,采用菌丝生长速率法和管碟法测定H50发酵液的抑菌活性以及发酵液的稳定性.发酵液的抑菌活性测定结果表明:H50发酵液对12株供试病原真菌均具有不同程度抑制作用,对其中6种病原真菌菌丝生长抑制率达50％以上,对油菜菌核病菌和黄瓜灰霉病菌的抑制率分别为98.3％和94.9％;H50发酵液对3种供试病原细菌中的枯草芽孢杆菌的抑制作用最强,抑菌圈直径为12.3mm.发酵液的稳定性检测结果表明:发酵液在80℃处理后抑菌活性开始下降,发酵液在pH值4.0～8.0条件下抑菌活性稳定,可见该菌株的代谢产物具有广谱抑菌活性和较强的热、酸、紫外光稳定性,具有潜在的开发价值.     

草莓炭疽病拮抗菌SKL108的分离、鉴定及拮抗活性

为了寻找优质高效的生物菌种资源,从森林土壤中分离出175个菌落特征相异的细菌,以草莓炭疽病病原菌为指示菌进行平板对峙试验,筛选出一株拮抗效果最强的生防菌SKL108,抑菌率高达93.22%。经16S rRNA系统进化树分析,结合细胞形态学观察和生理生化指标结果分析,将该菌株鉴定为萨拉曼卡假单胞菌(Pseudomonas helmanticensis)。利用平板对峙培养法研究该菌株的抑菌谱,结果表明,菌株SKL108对多种病原真菌的生长具有明显的抑制作用,包括常见的番茄灰葡萄孢菌、水稻立枯丝核菌、小麦禾谷镰孢菌等。这一研究结果是萨拉曼卡假单胞菌作为生防菌在农业上的首次报道,也表明该菌株具有开发成生物菌剂的潜力。     

ARDRA方法在荧光假单胞菌分离鉴定中的应用

【目的】探索荧光假单胞菌的分类方法，分离筛选拮抗性较强的荧光假单胞菌。【方法】利用紫外下产生荧光的特性，采用梯度稀释及鞭毛染色的方法，对采自云南、海南、山东和新疆的488份植物根际土壤进行分离筛选，分离菌株进行ARDRA分析，采用室内平板对峙法筛选对植物病原真菌具有较强拮抗作用的菌株，并对其进行生理生化分析和分子鉴定。【结果】分离筛选到102株紫外下产生荧光的杆状单极生鞭毛菌株。ARDRA分析产生荧光假单胞菌类型、恶臭假单胞菌类型以及一个未知的谱带类型。以油菜立枯病菌作为靶标菌，筛选到25株具有拮抗作用的菌株，其中TC222产生的抑菌圈最大，进一步的生测结果表明该菌株对9种重要的植物病原真菌如番茄灰霉病菌等具有很强的拮抗活性。TC222的 16S rDNA核苷酸序列与荧光假单胞菌PfO-1同源性达到99%，其最终鉴定为荧光假单胞菌。【结论】ARDRA方法在分子水平上为荧光假单胞菌的分离鉴定探索了一条新途径；TC222菌株具有拮抗多种植物病原真菌的能力，显示了良好的应用前景。     

粘帚霉不同菌株发酵液对4种植物病原真菌分生孢子萌发的影响

试验测定了5个粘帚霉(Gliocladiumspp.)菌株的发酵液对镰刀菌(Fusariumsp.)、链格孢菌(Alternariasp.)、玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum)、小麦根腐叶枯病菌(Bipolarissorokiniana)4种病原真菌分生孢子萌发的抑制作用,结果表明,供试的5个粘帚霉菌株的发酵液对供试植物病原真菌的分生孢子的萌发具有明显的抑制作用,不同菌株的抑制作用有所不同,HL-1-1菌株的抑制作用最强,其次为SS-1-1和SH-1-1。供试菌株对4种病原真菌分生孢子萌发率12h的抑制率均达到45%以上,最高可达88.39%。     

黄瓜疫霉菌拮抗内生细菌的筛选与鉴定

【目的】从黄瓜叶片中筛选抗疫霉菌效果好的内生细菌并进行鉴定,为进一步研究黄瓜疫病的理 论探索及防治应用提供实验材料。【方法】以黄瓜叶片为实验材料筛选内生细菌,根据待检菌株的镜检特征、 革兰氏染色反应、菌落排列方式和菌落形态特征等进行初步筛选。采用平板对峙法和发酵液拮抗法实验对目标 内生细菌进行拮抗作用测定。通过 16S rDNA 序列测定及同源性分析,并构建系统发育树确定目标菌株种属。 【结果】初步筛选出 32 株内生细菌将其编号为 CL1~CL32,其中革兰氏阴性杆菌 10 株、革兰氏阳性杆菌 13 株、革兰氏阳性球菌 9 株,利用平板对峙法发现 8 株对掘氏疫霉菌有较强抑制作用的拮抗菌株,菌丝抑制率为 10.3%~54.3%,抑菌半径为 1~7 mm,对其中抑菌效果较好的 3 株菌株（CL7、CL9、CL15）进行发酵液拮抗实验, 结果显示其抑菌率分别为 54.4%、72.2%、63.3%。【结论】对掘氏疫霉菌具有较强抑制作用的 3 株内生细菌（CL7, CL9、CL15）分别属于泛菌属 Pantoea sp.、假单胞菌属 Pseudomonas sp. 和葡萄球菌属 Staphylococcus sp.,其中 抑制效果最明显的为 CL9,即假单胞菌属 Pseudomonas sp.。