猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

本研究设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的特异性引物和TaqMan荧光探针，建立了一种检测PRRSV的快速、敏感、特异和重复性好的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在检测10^1拷贝／μL～10^7拷贝／μL模板范围内具有良好的线性关系，比常规RT—PCR更敏感，可分别检测最少为10拷贝的阳性标准品和1TCID。病毒。用建立的方法检测高致病性变异株HuN4第5代和第65代体外传代细胞毒人工感染6周龄～7周龄仔猪后的0h、3h、5h、7h、10h、14h、21h血清样品，以及HuN4第5代病毒攻击仔猪21d后迫杀的猪的脑、心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织样品病毒含量，结果发现HuN4第5代病毒感染仔猪3d后在血液中迅速复制，并在感染后7d血清病毒含量达到最高峰，接近10^10拷贝／mL。攻毒21d后，上述内脏组织中肺脏含毒量最多，接近10^9拷贝／g。HuN4第65代病毒在人工感染猪后21d的血清病毒含量最高，达到10^6拷贝／mL血清。     

基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片检测猪瘟病毒,猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及猪圆环病毒1型和2型

为了建立一种可同时检测区分猪瘟病毒(CSFV),猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的寡核苷酸基因芯片方法,本研究针对每种病毒设计了4条～6条寡核苷酸探针,检测低限为1.6×104PCV-2拷贝数/μL,1.6×104CSFV拷贝数/μL,1.6×105PRRSV拷贝数/μL,比琼脂糖凝胶灵敏约10倍。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法对76个仔猪样本进行了检测,检出了3种病毒的存在,其中25个样本(32.9%)同时感染了2种以上病毒。结果表明寡核苷酸基因芯片检测是一种快速、灵敏和高效的猪只混合感染病毒的病原学诊断方法。     

基于QIAxcel毛细管凝胶电泳分析系统的7种猪病毒检测方法的建立与初步应用

为建立同时检测7种常见猪病毒的毛细管凝胶电泳方法,本研究针对猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及非洲猪瘟病毒保守基因,设计7对特异引物,并在引物的5'端加入一段非同源性标签序列,再设计一对可识别标签序列的通用引物。经反应条件优化,建立了一种基于QIAxcel毛细管凝胶电泳分析系统的7种猪常见病毒多重PCR检测方法。该方法与O型猪口蹄疫病毒(FMDV-O)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等均无交叉反应,特异性强;所建立方法对7种病毒质粒标准品的检测下限分别为4.56×103拷贝/μL、6.35×103拷贝/μL、1.98×103拷贝/μL、1.32×104拷贝/μL、3.21×103拷贝/μL、4.51×103拷贝/μL、3.37×103拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示各靶条带数值间的变异系数均小于1%,该方法稳定,重复性高。该方法对65份临床样本检测结果与国标或行标单一PCR检测方法相比,二者对单一病原和混合病原检测的一致性分别为94.3%(33/35)、77.7%(14/18)。本研究建立的方法为毛细管凝胶电泳技术在动物疾病病原检测中的应用提供一定的参考。     

山东部分地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查

<正>猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊振母猪严重繁殖障碍,仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的高度传染性疫病。PRRSV对猪肺泡巨噬细胞有严格嗜性,抗原性极易发生变异,最终导致了目前流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)变异株的产生。在生产中,PRRSV感染发病后缺乏特征性病变,容易继发感染其他疾病,隐性感染也成为不     

SYBR Green Ⅰ实时PCR对猪细小病毒体外复制动态分析

根据已经发表的猪细小病毒（PPV）的VP2基因序列,设计2对特异性引物,建立了检测PPV的SYBR GreenⅠ实时PCR方法。该方法最小检出量为12个PPV拷贝。模板稀释度在108范围内呈良好的线性关系,与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒无交叉反应。应用本方法对PPV在体外感染细胞后的复制动态进行了观察,并绘制了病毒的体外增殖曲线。数据换算为每瓶中细胞内、外病毒拷贝数,结果显示细胞外病毒含量在接毒初始的36h逐渐下降,随后开始逐步增加;接毒后84h培养液中的病毒含量（1.739×1010拷贝）逐渐超过细胞内的病毒含量（1.321×1010拷贝）;在接毒后108h培养液中病毒含量达到峰值（7.626×1010拷贝）,随即病毒含量开始快速下降。细胞内病毒粒子在接毒后24h内为对数增长期,然后为缓慢增长期,至接种后72h达到复制峰值（1.425×1010拷贝）,并维持至108h。与病毒复制动态变化相对应的细胞病变是从细胞聚集、开始形成空斑到约80%的细胞病变产生,108h之后随着细胞的大量死亡,细胞内、外病毒数量都开始急剧减少。     

日粮添加罗伊氏乳杆菌LR1对猪常见病毒疫苗免疫效果的影响

试验利用前期筛选的猪源罗伊氏乳杆菌LR1全程替代饲用抗生素,旨在研究其对猪常见病毒疫苗免疫效果的影响。试验选取144头21日龄杜洛克×长白×大白断奶仔猪,随机分为3组,每组8个重复,每个重复6头猪。对照组(CON)饲喂基础日粮,抗生素组(OA)饲喂基础日粮+100 mg/kg喹乙醇+75 mg/kg金霉素(抗生素在第120天停用),益生菌组(LR1)饲喂基础日粮+5×10~(10) CFU/kg罗伊氏乳杆菌LR1,试验周期166 d。试验所有猪根据统一免疫程序进行疫苗免疫,并于试验开始第14、42、120、127、134、166天检测猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(HCV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、伪狂犬病毒(PRV)、细小病毒(PPV)抗体水平以及血清中IgG含量。结果表明:①与对照组和抗生素组相比,益生菌组第14天血清中口蹄疫抗体水平显著提高(P0.05);②与对照组相比,益生菌组和抗生素组第120天血清中的细小病毒抗体水平均显著提高(P0.05);③益生菌组第166天血清中的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平显著高于对照组(P0.05),且益生菌组第166天血清中的猪瘟抗体水平显著高于对照组和抗生素组(P0.05)。综上所述,日粮添加罗伊氏乳杆菌LR1在一定程度上能够提高猪常见病毒疫苗免疫后的抗体水平,提示其不仅可以作为饲用抗生素的潜在替代品,同时在预防和治疗猪病毒性疾病方面具有应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪后病毒与抗体消长规律

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种新的传染性疾病.猪繁殖与呼吸综合征病毒具有抗体依赖性增强作用(ADE),低滴度的特异性母源抗体或由免疫接种产生的低滴度的特异性抗体不但起不到免疫保护作用,还会使猪繁殖与呼吸综合征病毒更易进入血液中的单核细胞或肺泡中的巨噬细胞,促进猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制,导致长期的持续性感染,加重病情.     

PRRSV VR2332弱毒株经滴鼻、注射途径接种仔猪的病毒血症和抗体产生的差异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR2332弱毒株经滴鼻和注射两种途径接种仔猪的病毒血症、抗PRRSV抗体以及抗PRRSV中和抗体的差异,选取20日龄健康仔猪9头,随机分3组,即滴鼻组、注射组和对照组。在感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天前腔静脉采血,于第43天采血后摘取猪的脾、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结,并无菌收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR方法检测病毒载量。用ELISA方法检测抗PRRSV抗体效价,用基于PAM的中和试验检测抗PRRSV中和抗体效价。结果显示:仔猪感染PRRSV后,①滴鼻组第3天只在2头猪血清中检测到PRRSV,第15-19天病毒血症达到高峰,病毒拷贝数均大于104拷贝·μL-1,第27天后病毒血症消失;注射组第3天从3头仔猪血清中均检测到病毒,在第15-23天病毒血症达到高峰,其中第19天病毒拷贝数大于105拷贝·μL-1,病毒血症从第31天后开始消失。②从几种淋巴结和PAM中均检测到PRRSV,且注射组的PRRSV拷贝数稍高于滴鼻组。③均在第27天从血清中检测到抗PRRSV抗体,随后抗体水平一直处于逐渐上升趋势,且第35-43天,注射组的抗PRRSV抗体水平高于滴鼻组。④滴鼻组在第35天之前抗PRRSV中和抗体效价都小于1∶2,第43天抗PRRSV中和抗体效价为1∶2;注射组在第3、11和19天的抗PRRSV中和抗体效价均小于1∶2,第27、35、43天的中和抗体效价分别为1∶4、1∶8、1∶4。试验结果表明,注射组的病毒拷贝数一直为滴鼻组的10～100倍,且病毒血症持续时间更长;注射组血清中抗PRRSV抗体产生的时间比滴鼻组早,并且抗体水平比滴鼻组高;滴鼻组抗PRRSV中和抗体水平很低,注射组产生的抗PRRSV中和抗体比滴鼻组早且抗体水平高。综上所述,VR2332弱毒株经注射免疫比滴鼻免疫能刺激猪产生更高水平的中和抗体,但同时也会引发更高水平的病毒血症。     

母猪几种常见繁殖障碍疾病的诊疗及预防

1繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征（又称猪蓝耳病）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的,其主要表现在感染猪厌食,体温升高至40~41℃,妊娠期易发生早产,妊娠晚期易出现流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎等。该病无肉眼可见的特征性病理变化,确诊一般依靠采用猪肺泡巨噬细胞或传代细胞系进行病毒分离。     

高致病性猪蓝耳病的流行特点及防控措施

正高致病性猪蓝耳病(PRRS)又称猪繁殖与呼吸综合征,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高度接触性传染病。该病毒属冠状病毒科动脉炎病毒属,为有囊膜呈20面体或球形的RNA病毒。可从死胎、弱仔血液、肺、脾等组织分离到该病毒,能在猪肺泡巨噬细胞培养物上生长繁殖,并产生细胞病变。猪是猪繁殖与呼吸综合征病毒的惟一宿主,易感猪主要通过呼吸道感染,患猪和带毒猪是该病的主要传染源。病毒主要侵袭繁殖和呼吸系统,主要     

荧光定量RT-PCR法对高致病性PRRSV变异株感染猪体内分布规律的研究

根据GenBank发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株Nsp2基因序列设计1对特异引物,以重组质粒作为阳性标准品,采用SYBR-Green Ⅰ嵌合荧光染料建立了1种荧光定量RT-PCR方法用于检测该病毒核酸载量,在101~106拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.999 8,扩增效率为E=0.950,对质粒标准品最低检测限为12.8拷贝/μL,重复性检测的变异系数低于2.0%。用高致病性PRRSV变异毒株人工感染25日龄非免疫仔猪,对不同时间采集的血清进行了病毒核酸定量检测,结果表明病毒血症于攻毒后48 h被检测出,于7~10 d达到高峰,其病毒核酸载量能达到106拷贝/μL。试验猪临床表现为体温升高至40.5℃以上,持续7~11 d;出现嗜睡、打喷嚏、眼结膜炎、偶见一过性的耳尖发绀、皮肤苍白或有小疱疹、被毛粗糙、消瘦、便秘、后躯无力等临床症状。感染猪发生高热期与毒血症消长规律有一定相关性。对人工感染猪体内病毒分布检测结果表明,以多种脏器均有病毒存在,如扁桃体、淋巴结、心脏、肾脏中含量较高,肝、脾脏和肺次之,脑组织中也检测到病毒存在。试验表明,该方法可用于PRRSV变异毒株核酸定量检测,为该病毒致病性、致病机理、疫苗免疫及诊断等方面的研究提供了技术手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。     

猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R²=0.999;敏感性高,最低检测限为1×10¹拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。     

贵州规模猪场三种主要疫病调查情况与分析

为了解近几年贵州省部分规模养猪场猪瘟（HC）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）、猪圆环病毒2型（PCV-2）三种猪主要疫病的感染和免疫状况,采用ELISA方法对2011-2013年贵州省部分规模养猪场血清抗体进行了检测。结果显示,猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病的免疫效果较为理想,但猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒2型的隐性感染较为严重,应加强综合防控。     

参虎败毒颗粒体内抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果观察

为探究参虎败毒颗粒抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的作用,将20头PRRSV阴性仔猪随机平均分为4组,即提前药物处理感染组（A组）、感染同时药物处理组（B组）、无药物处理感染组（C组）和无药物处理不感染组（D组）。A和B组分别于攻毒前3 d和攻毒时在基础日粮中添加参虎败毒颗粒（每头10 g·d^-1）,连续饲喂至攻毒后28 d,每日测量体温,在攻毒后第14天,每组随机处死仔猪1头,观察病理变化,RT-qPCR检测肺组织病毒载量,并在攻毒后第1、3、5、7、14、21、28、35天采全血和血清样品进行PRRSV核酸和抗体检测。结果发现,A和B组仔猪体温在攻毒后第6天上升至40℃以上,第12天时恢复正常;C组仔猪体温在第5天上升至40℃以上,持续至试验结束仍未恢复。A、B组仔猪肺组织病变较轻,肺泡结构轻度损伤,支气管内有少量炎性渗出物,周围有少量炎性细胞浸润;C组仔猪肺组织病变严重,肺泡结构破坏严重,支气管内有大量炎性渗出物和炎性细胞浸润。A组在攻毒后3、5、7和14 d病毒载量极显著低于C组（P<0.01）;B组在攻毒后3和5 d病毒载量极显著低于C组（P<0.01）,第7和14天病毒载量显著低于C组（P<0.05）。A、B组PRRSV抗体在攻毒后第21天达到峰值,C组在28 d达到峰值。以上结果可知,参虎败毒颗粒能够显著减轻PRRSV造成的仔猪肺部病理损伤,降低病毒血症;添加药物可使PRRSV特异性抗体峰值提前,减少病毒血症持续时间,证明参虎败毒颗粒可用于预防或治疗PRRSV感染,降低PRRSV对仔猪的影响。     

猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了快速准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)并对病毒拷贝数进行定量,试验根据Gen Bank中PCV-2保守序列(登录号为FJ644559.1)设计1对特异性引物和Taq Man探针,制备标准品,建立PCV-2的荧光定量检测方法,并对临床样品进行检测。结果表明:该方法在1×101~1×108拷贝/μL的模板范围内具有良好的线性关系,相关系数可达0.999;敏感性是常规PCR方法的100倍;对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均为阴性,没有交叉反应;批内、批间重复试验变异系数均小于2.50%;在临床检测中,比常规PCR方法检测PCV-2的阳性检出率高出38%。说明试验成功建立了PCV-2 Taq Man荧光定量PCR检测方法,可用于临床检测PCV-2感染及对其拷贝数进行定量。     

猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型混合感染对仔猪肝肾损伤的研究

为研究猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染对仔猪肝肾的损伤,选择32头仔猪进行分组攻毒。攻毒后进行临床观察、病理剖检,分别在第3、7、14、21、35天采集肝、肾组织样品。通过HE染色、免疫组化染色、实时荧光定量PCR病毒检测,对感染仔猪肝和肾的病理损伤进行研究。结果发现,混合感染仔猪出现神经衰竭,第8~14天死亡。HE染色肝细胞水泡变性,浆液渗出,淋巴细胞浸润,中央静脉消失,肝细胞索紊乱,大量巨噬细胞增生。肾小球出血,肾小体结构被破坏。免疫组化定位可见病毒侵袭肝脏的细胞浆和汇管区,肾脏的肾小体边缘的细胞内。实时荧光定量PCR检测肝脏和肾脏病毒载量呈现上升趋势,PRV和PCV2均在感染第14天达峰值,PRV在肝脏和肾脏的载量分别为1 907.52拷贝/μL和938.97拷贝/μL,PCV2载量分别为635.28拷贝/μL和522.83拷贝/μL。表明PCV2和PRV混合感染仔猪肝和肾受到严重损伤,混合感染较各自单感染严重。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪外周血CD4、CD8分子动态变化研究

研究利用流式细胞仪对猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）后不同时期的CD4和CD8分子动态变化进行分析。结果表明：猪感染PRRSV后的第3天,CD4^＋和CD8^＋的数量开始急剧下降,在第12天达到最低水平;以后逐渐升高,CD4^＋的数量到第26天赶上并超过感染前的水平,在第33天又有所下降;而CD8^＋的数量在第19天就升高到感染前的水平。     

母猪繁殖障碍性疾病及其防治

1蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征,由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起。主要表现为,感染猪厌食,体温升高至40~41℃,妊娠期发生早产,妊娠晚期流产,产死胎、弱仔和木乃伊胎。该病无肉眼可见特征性病理变化,确认一般依靠采用猪肺泡巨噬细胞或传代细胞     

陕西省关中部分县（区）散养猪群PRRS流行情况调查

进行猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫苗安全及效力试验时,需要选用猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗原、抗体均为阴性的猪血清。为此,应用EUSA和RT—PCR方法对取自陕西省关中部分县（区）散养的未进行猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪群共计135份血清样品进行了PRRSV抗体和抗原测定。结果表明,PRRSV抗体阳性率为6．67％（9／135）．PRRSV抗体阴性猪群中抗原阳性率为11．11％（14／126）。由此可以得出,该地区农户散养的猪群存在感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的危险。