绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

试验旨在构建绵羊卵巢组织细胞的cDNA文库,为进一步研究绵羊卵巢中蛋白互作机制提供工具。本研究以不同发情周期的绵羊卵巢组织为材料,利用TRIzol试剂提取绵羊卵巢组织细胞总RNA,应用SMART技术经过长链PCR(LD-PCR)合成双链cDNA(ds cDNA),通过CHROMA SPIN~(TM)+TE-400柱纯化得到ds cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞。用同源重组的方式,在酵母细胞内构建绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA表达文库。结果构建了含有3×10~8个重组子的绵羊卵巢组织cDNA文库,插入片段长度多数为500～2 000 bp,重组率达96%,重组子中平均插入的片段长度为1 000 bp,文库滴度为2×10~7cfu/mL,符合建库标准。     

利用SMART技术构建猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库

本研究旨在建立猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库,进而为研究猪瘟病毒的基因功能及致病机理提供良好的试验体系。体外培养猪血管内皮细胞,提取细胞总RNA,并用Oligotex mRNA Mini Kit纯化PolyA+mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。经CHROMA SPINTM TE-400Column纯化后的dsDNA与线性化的pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞Y187中,以同源重组的方式在酵母细胞内构建猪血管内皮细胞cDNA文库。结果获得的文库容量在6×106 CFU/mL,随机挑选24个克隆进行PCR检测,插入的片段大小集中在400² 000bp之间,平均插入长度为1 000bp左右,文库重组率为100%。本研究为从文库中高通量地筛选出与猪瘟病毒互作的重组子,即寻找与该病毒相互作用的受体蛋白奠定了坚实的基础。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建

为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵相关的蛋白,利用酵母双杂交体系构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。提取纯化的子孢子总RNA,经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后,利用LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA),dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后dscDNA、pGADT7-Rec及Carrier DNA共转化到已经制备好的酵母感受态细胞Y187中,dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接,经过缺陷性培养基(SD/-Leu)的筛选得到酵母双杂交cDNA文库。结果显示,构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×105/μg pGADT7-Rec,文库滴度为3.62×107 cfu/m L。随机挑取32个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为200~2000bp,重组率为93.75%,并以该文库作为模板,用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增,获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。     

瑟氏泰勒虫感染的牛外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库构建及鉴定

为了研究牛瑟氏泰勒虫与牛外周血单个核细胞之间蛋白的相互作用,以自然感染瑟氏泰勒虫的牛外周血单个核细胞为材料,纯化并提取总RNA,应用SMART技术合成双链cD NA(ds cD NA)。利用纯化柱纯化ds cD NA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵母菌Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建牛外周血单个细胞的酵母双杂交cD NA表达文库。结果显示,文库容量为4.0×108CFU/mL,随机挑取单克隆进行菌落PCR检测,插入的双链cD NA片段大小集中在0.4~2.0 kb,文库重组率为95%。表明此文库达到要求,可用于酵母双杂交筛选。     

ST细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选与猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库。采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库。结果显示,文库滴度为8.1×10⁸ CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%。此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

应用LD-PCR法构建大片吸虫成虫cDNA表达文库

为构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,用Trizol试剂提取大片吸虫成虫总RNA,经反转录合成cDNA第一链,应用LD-PCR扩增方法,合成双链cDNA。用SfiⅠ内切酶修饰此双链cDNA,使形成两端分别带有SfiⅠA和SfiⅠB的黏性末端。经CHROMA SPIN-400柱纯化,收集400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有SfiⅠA和SfiⅠB末端的λTriplEx2噬菌体载体,经体外包装后,以XL1-Blue为受体菌构建cDNA表达文库。经测定,库容量为1.08×106PFU/mL,重组率为96.6%。扩增后的文库滴度为2.41×109PFU/mL,插入片段平均大小约为1 000 bp。这些结果表明已成功构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,适合进一步筛选大片吸虫新基因。     

鸭胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为了解与坦布苏病毒(TMUV)E蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,本试验制备鸭胚成纤维细胞(DEF)。采用Trizol法提取细胞总RNA,通过LD-PCR技术合成双链cDNA,经CHROMA SPIN TE-400column纯化后,与pGADT7载体连接,利用同源重组的方法克隆到Y187酵母感受态细胞,构建了鸭胚成纤维细胞的cDNA文库。结果显示:构建的文库滴度为3×107 CFU/mL,文库插入的双链cDNA片段为0.5~2.5kb,平均约为1.5kb,符合酵母双杂交筛选的要求。     

鸡法氏囊B淋巴细胞cDNA酵母表达文库的构建与鉴定

为了研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)与宿主B淋巴细胞作用机制,构建鸡法氏囊B淋巴细胞酵母表达文库,试验从3周龄SPF鸡中摘取法氏囊,分离制备B淋巴细胞,从中提取细胞总RNA,使用SMART和LD-PCR技术合成双链cDNA,并进一步与线性化载体pGADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,通过同源重组构建酵母表达文库。结果表明:所构建cDNA文库的效价为9.5×107cfu/mL,重组率为100%,可以用于酵母双杂交试验。     

猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

为研究猪瘟病-毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA.纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库.以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证.结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础.     

猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)与猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)蛋白质间相互的作用,本研究使用SMART技术成功构建了猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库。首先提取PAM总RNA,使用SMART RACE法经LD PCR合成双链cDNA,运用SMART技术,通过同源重组的方法将双链cDNA与pGADT7-Rec质粒共转化进酵母Y187感受态,再利用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选阳性克隆,最终构建的文库滴度达到了6.96×10~7 CFU/mL,重组率初步计算达到95%,插入片段范围在200~2 000bp。本研究为PRRSV致病蛋白的筛选以及相关疾病的研究奠定了基础。     

牛源犬新孢子虫NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

为筛选牛源犬新孢子虫AMA1与虫体互作的靶蛋白,构建NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-AMA1。本试验应用RT-PCR技术从虫体总RNA中扩增了去除跨膜螺旋的AMA1基因,定向克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组诱饵载体转化酵母Y2H,并验证其在酵母细胞中毒性作用和有无自激活现象。结果显示:本试验成功构建了诱饵载体pGBKT7-AMA1,并证明其对酵母细胞无毒性,且对报告基因无自激活。结果表明:诱饵载体pGBKT7-AMA1可用于酵母双杂交系统筛选与虫体互作的宿主蛋白。     

犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库的构建

试验旨在筛选水泡性口炎病毒的受体,构建犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。通过用Trizol试剂提取犊牛口腔黏膜上皮细胞总RNA,然后分离和纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,然后用EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶消化双链cDNA末端接头,使双链cDNA 2端含有EcoRⅠ和Hind Ⅲ黏性末端。所有处理后的双链cDNA,经Mini Column 纯化,收集400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接带有EcoRⅠ和Hind Ⅲ末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。经测定未扩增文库的滴度为1.3×10⁷ PFU/mL,重组率为95.8%,扩增后文库滴度为2.6×10¹⁰ PFU/mL。随机挑取100个噬菌斑进行PCR鉴定,95%的插入片段大于400 bp。结果表明成功构建了犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。     

梨酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

酵母双杂交是检测蛋白质之间相互作用的有效手段。构建梨酵母双杂交cDNA文库,能为利用酵母双杂交技术探究梨基因功能的互作机制提供技术支撑。本研究以沙梨主栽品种‘圆黄’梨的叶片和果肉为材料,采用Trizol法提取其RNA,利用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,通过同源重组法与pGADT7载体连接,再电转化至大肠杆菌菌株。经检测,构建的cDNA文库滴度为1.76×108 cfu/mL,文库片段插入阳性率为100%,片段长度主要分布在600~1500 bp。该研究结果表明,构建的cDNA文库质量较高,完整性较好,能为后续利用酵母双杂交技术鉴定基因的互作蛋白奠定基础。     

微小隐孢子虫微线蛋白GP900与MDBK细胞互作蛋白的筛选

通过筛选与微小隐孢子虫微线蛋白GP900相互作用的MDBK细胞蛋白,为进一步揭示微小隐孢子虫入侵宿主细胞的分子机制提供依据。首先构建重组原核表达质粒pGEX-4T-GP900,表达并纯化重组GP900蛋白;然后将重组GP900蛋白与MDBK细胞裂解液孵育,免疫共沉淀获得结合蛋白,质谱法分析与GP900互作的蛋白;最后用酵母双杂交进行验证。结果表明,成功构建pGEX-4T-GP900表达质粒,并纯化获得大小为43 kDa的重组GP900蛋白;免疫沉淀-质谱法筛选到2种与GP900相互作用的MDBK细胞蛋白,分别为膜联蛋白A2和热休克蛋白5;酵母双杂交技术验证了GP900与以上2种蛋白均有相互作用。为进一步阐明微小隐孢子虫入侵宿主细胞的分子机制奠定了基础。     

牛骨骼肌酵母双杂交cDNA文库构建

为构建应用于酵母双杂交系统的牛骨骼肌cDNA文库,利用Trizol法提取牛骨骼肌总RNA,采用SMART技术PCR扩增合成cDNA第二链片段,并与文库线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187构建酵母双杂交文库。结果显示文库容量达到1．7×10^7cfu／mL,插入片段主要在0．5～3kb范围内,文库重组率为80％。以上结果表明该文库质量好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白相互作用的蛋白质。     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×10⁸ CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。     

毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建

本文采用Trizol试剂提取毒害艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA,用oliogo(d T)磁珠法纯化m RNA后,采用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA噬菌体表达文库。经鉴定,原始文库容量为2.14×106pfu/m L,扩增后的文库容量为4.47×1010pfu/m L,扩增文库的重组率为90%。随机挑取100个单克隆,通过菌液PCR检测得知文库插入片段长度以400~1000 bp为主。本研究结果为毒害艾美耳球虫新基因的筛选和功能研究奠定了基础。     

华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库的构建及鉴定

构建华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础,也为进一步研究华支睾吸虫后囊蚴感染宿主的信号传导机制、探究其致病机理提供新的起点。从中国东北疫区（镇赉县）麦穗鱼肉里分离收集华支睾吸虫囊蚴,采用Trizol Reagent提取其总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第1链cDNA及第2链cDNA,加EcoRⅠ接头,经XhoⅠ酶切,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接,Gigapack III Gold包装蛋白体外包装,构建华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库。结果表明,构建的华支睾囊蚴cDNA表达文库的库容量为9.15×10⁵ PFU,重组率为99.5%,扩增后文库滴度为1.6×10¹⁰PFU/mL。成功构建了一高质量的华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库。     

鸡法氏囊B淋巴细胞三框cDNA表达文库的构建

分离纯化3周龄SPF鸡法氏囊B淋巴细胞的mRNA,以5'端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接3种读码框的Adapter,层析柱分级纯化,通过BP重组反应分别构建3种读码框的cDNA入门文库,平均滴度分别为1×105 CFU/mL、1×105CFU/mL、1.2×105CFU/mL,文库总容量分别为1.2×106CFU、1.2×106CFU、1.5×106CFU,平均插入片段分别为1 270 bp、1 190 bp和1 120 bp,阳性重组率均为100%.将3种读码框的cDNA入门文库扩增后提取质粒,取等量的质粒通过LR重组反应将入门文库转换为三框表达文库,经测定平均滴度为1×105CFU/mL,文库总容量为1.2×106CFU,平均插入片段为1 017 bp,阳性重组率为100%.结果表明所构建的三框cDNA表达文库具有较高的重组率和较大的库容量,为进一步筛选鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)在法氏囊B淋巴细胞中的受体及研究细胞嗜性奠定了基础.     

弓形虫酵母双杂交cDNA文库构建及与Rop38相互作用蛋白的筛选

为筛选与弓形虫棒状体蛋白38基因(Rop38)相互作用的宿主细胞蛋白,本研究利用MatchmakerTM Gold酵母双杂交系统,构建了人成纤维细胞(HFF)和人T细胞(CEM.NKR)的c DNA文库,以构建的p GBKT7-Rop38作为诱饵质粒,采用PEG/Li Ac法转化酵母菌株Y2H,利用表型筛选法检测Rop38的自激活作用并进行酵母双杂交筛选。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中无毒性和自激活作用,而且通过酵母双杂交筛选共获得29个与Rop38蛋白相互作用的宿主蛋白,其中HFF文库筛选到20个蛋白,CEM.NKR文库筛选到11个蛋白。本实验为进一步研究Rop38调节宿主细胞基因表达的信号通路奠定了基础。