新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测方法的建立及初步应用

根据基因库中新城疫病毒(Newcastle diseases virus,NDV)和鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)的基因序列,分别设计了2对针对NDV和DPV保守基因序列的引物。用这2对引物对同一样品中的NDV和DPV模板进行二重PCR扩增,结果同时得到了2条特异性的、大小与试验设计相符的419(NDV)和602 bp(DPV)的扩增条带,而对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出0.4 pg的NDV模板和126 pg的DPV模板。     

应用逆转录套式PCR检测新城疫病毒核酸

选择DNV融合蛋白保守的编码区域,设计并合成了一对外引物和一对内引物,建立并优化了检测新城疫病毒核酸的逆转录套式PCRI地,通过检测NDV感染的实验客观存在病料和临床病料,结果表明,逆转录套式PCR法最低能鉴别出约0.3pg的NDV RNA,攻毒后第8天还能从非免疫鸡和SPF鸡泄殖腔拭子中检出DNV,第8天非免疫鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为5/10,第8天SPF鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为6/10,对非免疫鸡和SPF鸡的泄殖腔中NDV最佳检出时间均在攻毒后第5天。逆转录套式PCRY应运地临床样品中DNV的最大检出率为6/7,经核酸杂交验证,该法具有很高的特异性和敏感性,也比较简便快速,为从分子水平探讨NDV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。     

纳米PCR技术检测溶藻弧菌的建立与初步应用

本研究根据溶藻弧茵（VA）的特异性基因toxR基因序列,应用primer6．0设计了1对特异性引物,并建立了纳金米金PCR方法,并对该方法的最佳反应条件、特异性和灵敏度进行了测定,采用2．0％琼脂糖电泳进行检测,结果表明本实验能扩增得到与实验设计相符的159bp（VA）的特异性条带;与副溶血弧菌、霍乱弧茵、麦氏弧菌、沙门氏菌、枸橼酸杆菌无交叉反应;纯培养细菌检测灵敏度可达22cfu／反应体系,同条件下比普通PCR的灵敏度高10倍。经临床检测,从120份带鱼、鱿鱼和鱼粉中检出8份阳性样品,与常规细菌分离鉴定方法符合率100％。本试验方法的建立对于加强进出口水产品中VA的检验检疫具有十分重要的意义。     

犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。     

1种检测新城疫病毒的微滴式数字PCR方法

本研究旨在构建一种新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR,ddPCR）。以NDV F基因为靶基因,选取保守区域设计引物和探针,构建了NDV ddPCR。对ddPCR反应引物和探针浓度、退火温度进行了优化,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行测定。试验结果表明,ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900和250 nmol·L^-1,最佳的退火温度为55℃。ddPCR的线性良好,最低检测下限为1.8 copies·μL^-1,与禽传染性支气管炎病毒等其他6种病毒无交叉反应,样本重复的变异系数为2.4%。结果提示,本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强,可对新城疫病毒感染的临床样品进行定量检测。     

非洲猪瘟病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为将纳米PCR技术引入非洲猪瘟病毒(ASFV)检测,本研究建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法,该方法采用纳米金颗粒作为热导介子,提高了PCR反应效率,采用该方法同时检测ASFV、大肠杆菌、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、典型猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪捷申病毒、猪脑心肌炎病毒等,结果只有ASFV能够扩增出552 bp的目的片段。敏感性试验表明纳米PCR检测技术是常规PCR检测技术敏感性的1 000倍以上,最低核酸拷贝数检出量可以达到10个拷贝。采用该方法对黑龙江、吉林和河南3个省份的8个地区临床送检的69份样品进行检测,检测结果显示均为阴性,在以上3个地区均未发现ASFV感染情况。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

鸡传染性支气管炎病毒纳米PCR检测方法的建立及初步应用

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的3′端非编码区保守区域,设计并合成一对特异性引物,建立IBV纳米PCR检测方法,并进行了特异性、灵敏性和重复性试验,然后将建立的方法进行初步应用。结果显示:该方法特异性良好,能从4种不同基因型IBV核酸样品中检测到约346bp的目的条带,而对禽偏肺病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、马立克氏病病毒、禽白血病病毒、鸭肝炎病毒等其他病原检测结果均为阴性;敏感性试验表明,纳米PCR的最低检测浓度为1.01×10^-4ng/μL,其敏感性是普通PCR的10倍;重复性试验显示3次均能检出IBV核酸。纳米PCR方法的临床应用表明,送检样品及攻毒鸡样品的检出率分别达到50%(10/20)和60%(30/50),与普通PCR方法检测结果符合率为100%。研究建立的IBV纳米PCR检测方法具有较高的敏感性和良好的特异性,为IBV的临床诊断、病原检测和流行病学调查提供了新的技术手段。     

同时检测禽流感和新城疫病毒的一步法荧光定量RT—PCR方法的建立

分别根据新城疫病毒与禽流感病毒的M基因、禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计了通用型禽流感病毒、H5＼H7＼H9亚型及通用型新城疫病毒5对特异性引物和5条Taqman荧光标记核酸探针。以阳性重组质粒进行体外转录后的RNA为标准品绘制标准曲线,建立了一步实时荧光RTPCR方法。结果表明,本试验建立的标准曲线Ct值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数大于0．99。通过利用所建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的临床样品进行检测,2种方法的检测结果符合率为100％,说明在临床样品检测、流行病学监测方面具有良好的应用前景。     

鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)L基因和番鸭细小病毒(MDPV)Vp3基因的保守序列,采用Primer Premier 5.0软件设计并合成了2对引物。通过优化反应条件及特异性、敏感性评价,建立了能同时检测鸭源NDV和MDPV的二重PCR方法。该方法对鸭源NDV和MDPV的检测敏感性分别为30和16 fg。同时使用该方法对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌进行检测,结果显示全为阴性。本研究建立的鸭源NDV和MDPV的二重PCR检测方法,具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭源NDV和MDPV感染的快速鉴别检测。     

鸭源新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒三重PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测鸭源新城疫病毒(DuNDV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭圆环病毒(DuCV)的方法,根据DuNDV、DPV和DuCV基因的保守序列设计了3对特异性引物,预特异扩增DuNDV片段大小为823 bp,DPV为576 bp和DuCV为338 bp.经过反应条件的优化,建立了DuNDV、DPV和DuCV的三重PCR检测方法.该方法特异性好,对鸭的其他病原检测结果为阴性;敏感性高,DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低检出限分别为2.59×103、1.12×103、4.67×102拷贝/μL.对180份病料进行检测,结果DuCV阳性10份,阳性率为5.6％;DuNDV阳性1份,阳性率为0.56％.结果表明,建立的多重PCR方法可以应用于DuNDV、DPV和DuCV的临床检测和流行病学调查.     

猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

根据已报道的猪细小病毒基因组序列，设计并合成了1对寡核苷酸引物，通过对影响PCR扩增因素的筛选，成功地从猪细小病毒感染的组织和细胞中扩增出445bp片段，回收该片段用EcoR I酶切得到了预期的结果，证实了该扩增片段的特异性。敏感性试验表明，该方法可以检测出10^-4个TCID50的病毒含量。利用该方法对临床上24份流产病科的检测，查出阳性16份，而同时利用HA检测阳性只有10份。这些结果说明本试验建立的PCR诊断方法灵敏度高、特异性强。     

禽腺病毒-Ⅰ群、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒多重PCR检测方法的建立

为快速检测禽腺病毒-Ⅰ群(FAV-I)感染,且能有效区分常见混合感染的新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV),本研究建立了多重PCR诊断方法。根据GenBank发表的FAV-Ⅰ的Hexon基因、NDV的F基因和IBV的N基因分别设计了3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化建立多重PCR诊断方法,并对该方法进行了特异性和敏感性研究,且对临床样本进行检测。结果发现,本研究建立的多重PCR方法可准确扩增出大小为895 bp(FAV-I)、1 600 bp(IBV)和529 bp(NDV)的特异性片段;3种引物最佳浓度分别为3 pmol/μL、3 pmol/μL和6 pmol/μL,最佳退火温度为55℃;该方法对3种病毒的最低检测限分别为1.46×10~5拷贝/μL、8.93×10~2拷贝/μL和2.11×10~4拷贝/μL;且该方法不能扩增出减蛋综合征病毒、马立克病毒、鸡传染性贫血病毒和H9亚型禽流感病毒等,临床样品检测结果与单项PCR结果相同。表明本研究建立的多重PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可有效地区分FAV-I、NDV、IBV。     

实时荧光定量PCR检测伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列(EF552427),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的细胞中提取DNA,进行PCR扩增.将鉴定正确的gE基因片段克隆入pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒.以该阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线.对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序.经临床应用表明,该荧光定量PCR方法的建立为猪伪狂犬病病毒的早期诊断并定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础.     

山羊痘病毒和羊口疮病毒双重PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank发表的山羊痘病毒（goatpox virus,GPV）和羊口疮病毒（orf virus,ORFV）基因序列,分别合成针对GPV ITR和ORFV H2L基因片段的2对引物,以GPV和ORFV的核酸混合物作为模板,经优化反应条件,成功建立了快速鉴别检测GPV、ORFV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对GPV与ORFV核酸的扩增能获得289和507 bp的特异性目的片段,而对FMDV、FPV、BTV、健康山羊皮肤的核酸扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4 pg,对ORFV核酸为0.4 pg;对临床采集的12份病料进行双重PCR扩增,GPV检出率为25%（3/12）,ORFV的检出率为75%（9/12）。结果表明,建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和ORFV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。     

应用PCR技术检测伪狂犬病病毒

根据伪狂犬病病毒(PRV)的gE基因序列,设计并合成了一对引物,以闽A株DNA为模板,建立了检测PRV的PCR方法。该方法能从猪细小病毒闽A株和FB株中扩增出一条长度为1 808 bp的片段,对Bartha株、gE-株检测为阴性;而以猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和正常细胞的核酸为模板的均为阴性;敏感性试验表明,该体系可检测到10pg的猪细小病毒基因组DNA。表明该方法适用于检测猪伪狂犬病病毒野毒株或非gE基因缺失弱毒株。     

纳米金PCR技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用

纳米金PCR是在普通PCR基础上发展起来的新技术,它能够明显提高普通PCR的灵敏度和特异性。根据副溶血弧菌(VP)的toxR基因序列,应用primer6.0设计一对特异性引物,建立了纳米金PCR方法,并对该方法的最佳反应条件、循环数、特异性和灵敏度进行测定。采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果表明能扩增得到与试验设计相符的208bp(VP)的特异性条带;与溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门氏菌、枸橼酸杆菌没有交叉反应;纯培养细菌检测灵敏度为3cfu/反应体系。与普通PCR法进行比较,该方法检测灵敏度比普通PCR高10倍。经临床检测,从150份带鱼、鱿鱼和鱼粉中检出5份阳性样品,与常规细菌分离鉴定方法符合率100%。该试验方法的建立对于加强进出口水产品中VP的检验检疫具有十分重要的意义。