猪Ghrelin基因的克隆及原核表达

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．     

蒙古绵羊Ghrelin基因的克隆和原核表达

为了克隆蒙古绵羊Ghrelin基因,构建其原核表达载体,并检测其在大肠杆菌中的表达情况.本研究用RT-PCR方法从蒙古绵羊胃组织mRNA扩增获得Ghrelin基因的cDNA序列,克隆到pMD-19T载体后进行序列分析.将测序正确的cDNA序列与原核表达载体pET-32a(+)连接,并转化BL21( DE3)大肠杆菌.经...     

水牛MD-2cDNA基因的克隆与原核表达

为探讨水牛抵抗革兰阴性菌感染的免疫机制,克隆、表达了水牛髓样分化蛋白-2(bMD-2)基因,并用Western blot进行鉴定.采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bMD-2基因,构建pET28a-bMD-2表达载体,转化至大肠埃希菌BL21( DE3)中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Wester...     

水牛Sox2基因原核表达载体的构建与诱导表达

水牛Sox2基因对体内胚胎的早期发育至关重要,它是重要的多能性干细胞(iPS细胞)标记基因之一,试验通过双酶切重组质粒pMD18-T-Sox2,将水牛Sox2基因定向克隆入原核载体pET-32a(+),成功构建了原核表达载体pET-Sox2,然后利用IPTG诱导,获得诱导表达蛋白,并经过SDS-PAGE电泳分析和Wes...     

水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku.     

猪IL-18基因原核表达载体的构建及表达

以含新兴猪IL-18基因的真核质粒pcDNA3.1-pIL18为模板,扩增出新兴猪IL-18基因,将其定向克隆至原核表达载体pET32c和pET41c的SacⅠ和KpnⅠ位点,构建了原核表达载体pET32c-pIL18和pET41c-pIL18。经酶切和PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性新兴猪IL-18基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)细胞,筛选的阳性菌落经SDS-PAGE分析及Western-blotting分析,表明成功构建了表达重组猪IL-18的大肠埃希菌基因工程菌株。蛋白的可溶性分析表明,重组蛋白呈不可溶表达,在菌体内以不溶性的包涵体形式存在。     

LacS基因原核表达载体构建及重组蛋白表达

克隆得到硫矿硫化叶菌中的糖苷酶基因LacS,利用原核表达载体pASK-IBA-2构建重组质粒pASK-IBA-2-LacS,酶切和测序鉴定证实LacS基因成功插入且基因阅读框正确。重组质粒pASK-IBA-2-LacS转化大肠杆菌Rosseta,去水四环素诱导后,菌液裂解离心亲和层析获得重组蛋白,western blot证实LacS在大肠杆菌Rosseta能高效表达。     

人SOD基因的克隆与原核表达

超氧化物歧化酶(SOD)是机体内超氧自由基的天然清除剂,在抗衰老、抗辐射、抗逆境,消炎、抑制肿瘤和癌症,以及自身免疫疾病的治疗方面有很重要的作用。我国目前主要从血液中提取SOD,有关重组人SOD的研究较少。文章通过RT-PCR方法克隆得到人SOD基因,并成功构建其原核表达载体pET-16b-SOD,为通过基因重组技术生产人SOD创造了条件。     

贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin基因的克隆及原核表达

采用特异性引物自贵州黑羽乌骨鸡胃部组织克隆了Ghrelin的基因,基因全长2330bp,含有4个外显子,3个内含子.采用RT-PCR技术,获得了Ghrelin cDNA片段(563 bp),序列分析推测,通过可变剪切可产生两段mKNA,cDNA编码区与基因组中的编码区完全一致.黑羽乌骨鸡Ghrelin基因与已知鸡种比较有13～18个碱基不同,相似性为99.1%～99.3%,但其氨基酸序列完全一样,表明禽类的Ghrelin多肽高度保守.将其中Ghrelin编码区亚克隆到原核表达载体pTYB11中,经序列测定碱基序列正确,获得重组质粒pTYB11/G.在IPTG的诱导下,重组质粒在大肠杆菌ER2566中获得表达.当OD600=0.5,IPTG为浓度1 mmol/L,诱导5小时的表达量最高,融合蛋白占细胞总蛋白的40%.采用几丁质结合的预装柱对表达产物进行纯化,产率约为5 mg/L培养液.     

牛抵抗素基因的克隆及原核表达

从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。     

梅花鹿colX基因的克隆及原核表达

提取健康梅花鹿鹿茸肥大软骨细胞总RNA,以RT-PCR获得colX基因2 038 bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD18-T中,经限制性内切酶和质粒PCR分析,并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以IPTG诱导,经SDS-PAGE及Western-blot分析表明,获得相对分子质量为65 000的colX蛋白表达带,与预期相符,表明成功获得梅花鹿colX基因蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征RT-PCR诊断及ORF5基因原核表达载体的构建

参照GanBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒核苷酸序列,利用生物软件,设计1对ORF5基因的特异性引物,用Trizol法提取病料的总RNA,进行RT-PcR扩增后获得目的基因,将其连接到PMD18-T载体后转入大肠杆菌Top10细胞中,抽提质粒并双酶切,回收目的基因,然后克隆于原核表达载体PET-32a(+)中,通过抗性筛选、酶切鉴定和序列测定,证实得到含有目的基因的阳性克隆,本实验成功构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因原核表达载体PET-ORF5,为进一步研究ORF5基因的原核表达及猪繁殖与呼吸综合征的基因工程疫苗的研究奠定了基础.     

鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析

旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础.本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118 bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率.结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达.SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Nix在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础.     

应用 RACE 技术扩增柞蚕 Lectin基因及原核表达载体构建

根据其它昆虫Lectin基因同源序列分析，设计引物对，以柞蚕幼虫总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增获得了176 bp的部分柞蚕Lectin基因序列。根据获得的已知序列分别设计引物，采用3＇-RACE 和5＇-RACE 技术手段分离、克隆柞蚕Lectin基因，将编码区全长DNA序列克隆并连接至PET-28 a （＋）中构建原核表达载体。结果为后续柞蚕Lectin基因原核表达、抗体制备及其功能研究奠定基础。     

福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。     

鸡干扰素-α基因原核表达载体的构建及高效表达

干扰素（IFN）-α因其具有很强的抗病毒活性而备受关注。本研究根据GenBank上公布的鸡IFN-α核酸序列设计1对引物,用PCR方法扩增出鸡IFN-α基因,并将其克隆到原核表达载体pET-32a及pET-30a-DsbA上,得到重组质粒pET-32a-IFN-α及pET-30a-DsbA-IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析,结果表明pET-30a-DsbA-IFN-α表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约40.4 ku,表达产物主要以包涵体形式存在,且表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。     

猪干扰素-δ基因原核表达载体的构建及高效表达

干扰素(interferon,IFN)因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而备受关注。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核苷酸序列设计1对引物,通过PCR方法扩增出猪 IFN-δ基因,片段大小为513 bp,并将其克隆到原核表达载体上得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta BL21(DE3)受体菌,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明,pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20 ku,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。     

中华蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体的构建

【目的】对中华蜜蜂(Apis cerana cerana)中自噬相关蛋白Atg8家族成员γ-氨基丁酸相关受体蛋白(gamma-aminobutyric acid receptor type associated protein, GABARAP)基因进行克隆鉴定和生物信息学分析,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,以期为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】根据GenBank中西方蜜蜂(Apis mellifera)GABARAP基因序列(登录号:XM₀01120069.5)设计引物,采用巢式PCR对中华蜜蜂GABARAP基因进行扩增、克隆;运用生物信息学软件对其氨基酸序列相似性、二级结构、三级结构进行比对和预测分析;构建GABARAP基因原核表达载体,利用Western blotting对GABARAP蛋白进行鉴定后并用IPTG诱导纯化。【结果】经巢式PCR扩增得到中华蜜蜂GABARAP基因序列;使用在线BLAST工具对氨基酸相似性进行分析显示,中华蜜蜂GABARAP与西方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、东方熊蜂的氨基酸序列相似性为100%;...     

水牛Ghrelin基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的牛、人等物种的Ghrelin核苷酸序列设计合成一对引物,以水牛皱胃组织总RNA为模板,采用RT-PCR法,扩增出Ghrelin成熟蛋白编码cDNA序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明,扩增的水牛Ghre-lin基因编码序列长为351 bp,编码116个氨基酸。同源性分析表明,水牛Ghrelin基因与牛、人、猪、小鼠及绵羊基因相应序列的同源性分别为97%、79%、81%、75%和95%,氨基酸同源性与牛、羊、人、猪、小鼠分别为96%,94%,73%,76%和75%,说明Ghrelin是一组在进化上高度保守的蛋白质。水牛Ghrelin成熟蛋白cDNA的成功克隆,为进一步研究水牛Ghrelin基因结构、基因表达与调控奠定了基础。