新疆部分地区牛传染性鼻气管炎病毒感染的检测与gD基因序列分析

为了调查新疆部分地区牛传染性鼻气管炎病毒的感染情况,试验从新疆石河子、奎屯、库尔勒、沙湾、阿克苏地区的五个规模化奶牛场采集1月龄以内犊牛鼻液126份,其中发病犊牛86份,相同日龄健康犊牛40份,采用双抗体夹心ELISA方法检测牛传染性鼻气管炎病毒抗原,PCR方法检测牛传染性鼻气管炎病毒g D基因,并挑选不同地区的9株病毒进行序列分析比较其同源性。结果表明:ELISA方法检测的感染率为19.84%,PCR方法检测的感染率为47.62%,g D基因序列同源性为77.80%~99.80%。说明新疆部分地区牛传染性鼻气管炎病毒感染较为普遍,且多数毒株之间基因变异较大。     

新疆阿克苏地区牛传染性鼻气管炎病毒与牛副流感病毒3型感染的检测

为调查阿克苏地区是否存在牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)与牛副流感病毒3型(BPIV-3)的感染,从阿克苏两个规模化奶牛场采集1月龄以内可疑发病犊牛鼻液样品18份,采用双抗体夹心ELISA方法检测两种病毒的抗原,PCR方法检测牛传染性鼻气管炎病毒gD基因,RT-PCR方法检测牛副流感病毒3型的gM基因。结果表明,ELISA方法检测IBRV和BPIV-3的感染率分别为22.22%和0%;PCR方法检测IBRV的感染率为72.22%;RT-PCR检测BPIV-3的感染率为44.44%;同时患有两种病毒的检出率为22.22%。说明在阿克苏地区存在IBRV与BPIV-3的感染,且存在两种病毒的双重感染。     

1株B基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

为探究新疆某集约化牛场1～6月龄犊牛群中牛副流感病毒3型(BPIV3)的感染情况,对采集的60份犊牛鼻拭子样品进行RT-PCR检测、病毒分离鉴定及全基因组测序和遗传进化分析。结果显示,样品中BPIV3核酸阳性率为11.67%。从核酸阳性样品中分离获得1株BPIV3,并命名为XJ21032-1(45),其基因组全长为15 512 bp;遗传进化分析表明,XJ21032-1(45)属于BPIV3 B基因型,该分离株与澳大利亚的BPIV3 B基因型参考株Q5592(EU277658)的同源性最高为93.4%。本研究成功分离得到了1株B基因型BPIV3,证实B型毒株在我国的存在和流行,为BPIV3疫苗研发提供了原材料,也有助于我国BPIV3分子进化规律及溯源的进一步研究。     

牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。     

一株c基因型牛副流感病毒3型病毒的分离鉴定

从黑龙江省某牛场当中患有呼吸系统疾病的病牛鼻拭子中分离到一株病毒,该病毒在MDBK细胞上能够产生典型的病变。经免疫荧光鉴定表明成功分离到一株牛副流感病毒3型,命名为HLJ1。将病毒的M基因与GenBank中已发表BPIV3毒株的M基因进行同源性比较及系统进化分析,结果表明HLJ1与BPIV3c型参考毒株NX49的同源性最高为99.7%,因此HLJ1分离株属于c基因型BPIV3。我们的结果将为牛副流感病毒3型检测试剂盒及疫苗的研发工作奠定基础。     

新疆北疆某规模化牛场奶牛副结核病的检测与分析

为查明导致新疆北疆某规模化牛场奶牛腹泻、消瘦的主要病原菌,本研究采用微生物学与分子生物学方法对采集的患牛粪便进行检测与鉴定。结果显示:2份粪样抗酸染色阳性,IS900基因及亚型分型基因检测阳性,IS900基因与GenBank中多个副结核分枝杆菌序列同源性在99%以上,亚型分型基因与Ⅱ型同源性为99.81%,从而确定2份样本均被Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌感染。     

牛副流感病毒3型核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立以牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)为包被抗原的间接ELISA方法,本研究扩增BPIV3的NP基因并克隆于原核表达载体,获得重组表达质粒p ET30-NP。将其转化至表达菌BL21(DE3),获得了可溶性表达的重组N蛋白,用镍柱在非变性条件下纯化后将其作为包被抗原,建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示作为包被抗原的重组N蛋白仅与BPIV3阳性牛血清发生特异性反应,与牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒等牛的常见病原无血清学交叉反应,表明其特异性较强。牛BPIV3阳性血清在1:640倍稀释时按该方法检测仍为阳性,显示该方法具有较高的敏感性。重复性试验显示批内变异系数小于6%,批间变异系数小于12%,表明该方法具有较好的稳定性。对94份牛血清的比较试验显示,本研究建立的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率为98%。利用该方法检测了394份采自接种过BPIV3灭活苗牛场的血清样品和95份未接种疫苗牛场的血清样品,结果接种疫苗的牛血清均呈强阳性,而95份未接种疫苗牛血清的阳性率为80%。本研究建立的间接ELISA方法可以试用于国内BPIV3的流行病学调查和免疫监测,为国内BPIV3的防控提供技术支持。     

山羊副流感病毒3型NP蛋白的截短表达及间接ELISA方法的建立

为建立山羊副流感病毒3型ELSIA抗体检测方法,利用DNAStar生物信息学软件对山羊副流感病毒3型NP蛋白抗原区域进行预测,利用Primer 6.0软件设计合成1对引物,通过RT-PCR技术扩增到807 bp基因片段,将其连接到原核表达质粒pET28a(+)中,成功表达了相对分子质量约39 000的目的蛋白,以纯化后的蛋白为包被抗原,建立检测山羊副流感病毒3型的ELISA抗体检测方法,并对方法的敏感性、特异性、稳定性进行了验证。结果显示,建立的方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点;对送检的745份临床羊血清进行检测,总阳性率为14.5%。本试验建立的间接ELISA检测方法为山羊副流感病毒3型抗体的快速检测及流行病学调查提供了技术支持。     

内蒙古地区部分奶牛场牛副流感血清学调查

为了解内蒙古地区奶牛场牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus 3,BPIV3）的感染状况,采用酶联免疫吸附法（ELISA）对6个奶牛场进行血清学调查。结果表明,该地区奶牛场中普遍存在BPIV3的感染情况,6个奶牛场均为阳性,阳性率最高达100%（15/15）,阳性率最低为90.90%（20/22）,平均阳性率为95.20%（119/125）。     

牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用

为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP (rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105.间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgGl/κ.特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应.免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原.该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件.     

北方三省(区)牛副流感病毒3型的血清学调查

为了解我国北方三省(区)牛副流感病毒3型(BPIV3)的感染状况,从内蒙古、吉林、山西3个省采集牛血清样品482份。采用病毒中和试验方法进行BPIV3抗体检测。结果显示,482份血清中BPIV3阳性共439份,阳性率为91.08%。吉林、内蒙、山西3省区中血清BPIV3阳性率分别97.35%、84.31%、95.15%。研究表明,中国北方三省(区)牛群中普遍存在BPIV3的感染。     

新疆部分地区致犊牛腹泻轮状病毒的检测及VP6基因序列分析

为了调查新疆部分地区规模化奶牛场致犊牛腹泻轮状病毒的感染情况,查明该病毒在致犊牛腹泻中的作用,试验采用双抗体夹心ELISA、RT-PCR的方法检测轮状病毒抗原及VP6基因,并对该基因进行序列分析以比较其同源性。结果表明:各牛场腹泻犊牛粪便的轮状病毒阳性检出率为23.08%~90.91%;在健康犊牛粪便中,仅从石河子某奶牛场检出轮状病毒,检出率为38.89%;RTPCR扩增得到大小为383 bp的片段;8份克隆毒株序列的同源性为97.9%,同源性较高。说明新疆部分地区犊牛感染轮状病毒十分普遍,轮状病毒是引起犊牛腹泻的主要病原之一,部分健康犊牛带毒但未发病。     

牛副流感病毒3型(BPIV3)P蛋白磷酸化位点与功能性结构域分析

为解析牛副流感病毒3型(BPIV3)SD2014分离株P蛋白磷酸化位点与功能性结构域,首先对P基因全长进行克隆测序,并与SD0835株P基因进行比较;再利用DNAStar中的MegAlign软件,以Clustal W方法比较了副黏病毒不同种属15株参考毒株的P蛋白氨基酸序列的同源关系,并对23株牛、人和猪副流感病毒3型P蛋白氨基酸序列进行比对筛选保守的氨基酸位点;运用在线Netphos 2.0Server和NetPhosK 1.0Server软件分别预测BPIV3SD2014毒株P蛋白潜在的磷酸化位点和特异性磷酸化蛋白激酶作用位点,最后将P蛋白4个主要功能性结构域氨基酸位置与潜在磷酸化位点一一对应。结果发现,SD2014毒株P基因核苷酸序列与SD0835株同源性为99%,P蛋白氨基酸序列与猪副流感病毒3型(SPIV3)同源性最高为73.2%。P蛋白在398~479aa含有1段螺旋卷曲结构,推测是介导P蛋白四聚体的形成以及与L蛋白的相互作用的位点,同时发现PKC是唯一一个贯穿于所有功能结构域的蛋白激酶。本研究为进一步解析P蛋白磷酸化在调控BPIV3转录与复制过程中的作用奠定基础,同时也为研究P蛋白的生物学功能提供支撑。     

牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法。结果显示,方法可同时扩增出BPIV3 A型150 bp、B型253 bp和C型342 bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×10⁴、0.92×10⁴和1.53×10⁴拷贝/μL。本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型。     

牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法。结果显示,方法可同时扩增出BPIV3A型150bp、B型253bp和C型342bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×104、0.92×104和1.53×104拷贝/μL。本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型。     

山东东部地区规模化奶牛场引起奶牛呼吸道综合征的4种常见病毒血清学调查

为了解目前山东东部地区牛病毒性腹泻黏膜病病毒、传染性鼻气管炎病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3型这4种病原的感染情况,为疫病防控提供依据,从山东潍坊、烟台、青岛、威海等地区采集牛血清样品380份,采用ELISA方法进行了4种病毒的抗体检测。结果显示,BVDV抗体阳性率为62.11%;IBRV gB抗体阳性率最低为42.63%;BRSV抗体阳性率82.11%;BPIV3抗体阳性率81.05%,BRSV和BPIV3感染情况基本持平。被调查的14个牛场有12个牛场曾发生过4种病毒的感染,4种病毒均感染过的牛的比率在83.68%(318/380)。研究表明,山东东部地区多数规模化奶牛场存在这4种病毒的感染。     

牛副流感3型病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛支原体多重PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感3型病毒(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛支原体(M.bovis)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的BPIV3的HN基因、IBRV的g C基因、BVDV的5'UTR和M.bovis的oppD/F基因序列设计特异性引物,通过优化反应条件建立了一种可以同时检测以上4种病原的多重PCR方法。结果显示,该方法对牛呼吸道合胞体病毒、小反刍兽疫病毒、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀巴氏杆菌A型和B型无特异性扩增,对BPIV3和BVDV的cDNA最低检测量分别为100 pg和1 ng,对IBRV和M.bovis的DNA最低检测量分别为10 pg和100 pg,具有较高的特异性和灵敏性。对临床33份鼻拭子样品和12份牛肺样品的检测结果与已发表文献中PCR方法的检测结果一致。本研究建立的多重PCR检测方法可同时对BPIV3、IBRV、BVDV和M.bovis进行检测,为这4种病原的诊断和检测提供了一种实用、便捷的方法。     

致犊牛肺炎和关节炎牛支原体新疆株的分离与鉴定

自2010年7月以来,新疆北疆部分地区某些奶牛场犊牛陆续出现严重的肺炎和关节炎,为确定其病原,无菌采集8个牛场病死犊牛的肺脏和关节液,患病犊牛的血清和部分鼻拭子,病料接种筛选培养基,通过菌落形态观察、特异性PCR鉴定、生长抑制试验和血清学检测,确定牛支原体15株,其中7株牛支原体克隆测序,与PG45 OPP F基因同源性为97.32%~100.00%。牛支原体ELISA试剂盒检测92份血清显示,阳性率82.61%。结果表明,该地区奶牛场发病犊牛以牛支原体感染为主。     

牛副流感病毒3型SYBR Green Ⅰ Q-PCR方法的建立

本研究建立了检测牛副流感病毒3型的SYBR Green Ⅰ Q-PCR方法。根据Gen Bank发表的BPIV3序列进行对比分析,选取P基因上保守区域设计特异性引物。优化反应体系,建立Q-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。结果显示,构建的标准曲线在10~4~10~8copies.μL~(-1)内具有较好的线性关系,相关系数达到0.998,斜率为-3.370,Q-PCR扩增效率为98%。特异性试验中,利用该方法对BPIV3a及BPIV3c进行检测为阳性,对牛疱疹病毒I型、牛病毒性腹泻病毒进行检测,结果呈阴性。敏感性试验中,该方法对标准品的最小检出量为1.0×10~3 copies.μL~(-1)。重复性试验中,Ct值变异系数均小于1.0%。表明SYBR Green Ⅰ Q-PCR法能够快速地对病原进行诊断,该方法具有较强的特异性、良好的敏感性及重复性,为实验室诊断及定量分析提供了更快速、稳定、可靠的方法。     

新疆某牧场牛病毒性腹泻的诊断及防控

为了查明新疆某规模化牧场犊牛发病死亡的原因,本试验采用现场流行病学调查结合实验室检测方法进行研究。结果表明,该病的发病率为39.43％,病死率为32.14％,易感牛群主要是3月龄以内的犊牛,具有典型BVD症状,病理变化以消化道症状为主,病死牛肠道有大量出血点、肠黏膜溃疡、脱落、肠壁菲薄、胃肠道内容物中有大量气泡、肠系膜淋巴结肿大等;RT-PCR检测结果表明4份病死犊牛的肠组织、32份发病犊牛和3份（3/10）同群亚健康犊牛肠内容物核酸均为阳性;序列对比分析结果表明,该牧场感染的病毒为BVDV-1a型,与Genbank上登陆的部分BVDV-1型参考株的同源性为88.0％-98.4％,与部分BVDV-2型参考株的同源性为31.5％-43.7％;结合实验室检测及临床防控需求,牧场采取了净化阳性牛结合BVD-IBR二联疫苗免疫的方式有效地控制了该病的进一步发生。