鸭坦布苏病毒分离鉴定及其囊膜蛋白遗传进化分析

【目的】 了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】 通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】 分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】 成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。     

鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备和治疗效果分析

为了制备、筛选和评价治疗鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染的中和抗体,本试验克隆DTMUV E基因,连接至原核表达载体pET-30a(+),转化至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态,提取质粒,鉴定重组质粒pET30-E,转化E.coli BL21感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析E蛋白表达,使用镍柱亲和层析纯化E蛋白,将E蛋白与弗氏佐剂混合、乳化,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠3次后,取小鼠脾脏,分离脾细胞,在聚乙二醇(PEG)的作用下,将脾细胞与SP2/0细胞融合,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选分泌抗E蛋白抗体的杂交瘤细胞株,通过Western blot进行单克隆抗体鉴定,通过间接免疫荧光技术检测DTMUV,病毒中和试验评价单克隆抗体中和DTMUV感染的能力,并评价单克隆抗体治疗DTMUV感染小鼠的能力。结果显示,含质粒pET30-E的E.coli BL21经诱导后可在裂解的沉淀物中表达E蛋白;制备的E蛋白单克隆抗体4A1可以与E蛋白发生免疫反应,不与鸭A型肝炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细...     

日本脑炎病毒囊膜蛋白的基因原核表达及抗原性分析

参照GenBank中的日本脑炎病毒序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因得到cDNA,克隆至pMD-18T载体,经测序证实后亚克隆至原核表达载体pET-28a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a/JEV E,目的蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot检测表明,表达产物与兔抗JEV多克隆抗体呈阳性反应,在ELISA试验中,用表达出的E蛋白包被,能够很明显地区分出猪日本脑炎阴性、阳性血清。     

鸭坦布苏病毒prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)膜前体蛋白(prM)的单克隆抗体,将原核表达的重组prM蛋白配伍佐剂免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌抗DTMUV prM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3H4和5C10。2株杂交瘤细胞均能稳定分泌抗体,制备的腹水抗体效价分别为1∶51 200和1∶102 400。亚型鉴定结果显示,3H4和5C10单克隆抗体的重链均属于IgG2b,轻链均为Kappa型。Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,这2株单克隆抗体均能与BHK-21细胞中感染的DTMUV发生特异性反应,而与同属的日本脑炎病毒无交叉反应。微量病毒空斑减少中和试验结果表明,这2株单克隆抗体均具有中和活性。进一步原核表达prM蛋白不同截短体,发现2株单抗针对不同表位,均位于prM蛋白的pr片段上。本研究制备的单克隆抗体3H4和5C10为快速检测DTMUV感染和研究prM蛋白的结构与功能奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒E蛋白Domain Ⅲ单克隆抗体胶体金试纸条的创制及应用

为建立一种快速诊断鸭坦布苏病毒（DTMUV）的方法,以2株（B9D7B8G10和B9D10C7株）抗DTMUV的单克隆抗体制备DTMUV胶体金免疫层析试纸条。采用经典的柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液,利用rProtein G琼脂糖凝胶亲和层析法对两株单克隆抗体腹水进行纯化并鉴定;以纯化的B9D7B8G10株单克隆抗体作为标记抗体,通过调节单克隆抗体浓度与pH确定胶体金探针最佳结合条件;同时,在硝酸纤维素膜（NC膜）检测带包被纯化的B9D10C7株单克隆抗体,质控带包被山羊抗小鼠IgG抗体,建立检测DTMUV胶体金免疫层析试纸条;成功建立试纸条后,对试纸条敏感性、特异性、重复性和稳定性进行检测,并与RT-PCR检测方法进行比较,对200份临床疑似感染样品进行检测。结果显示：制备的胶体金试纸条在15 min内即可完成检测,最低检测稀释度为1:50,且不与鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅星状病毒、禽白血病病毒发生交叉反应;应用试纸条和RT-PCR方法分别对200份临床疑似样品进行检测,两者符合率达98%。结果表明,制备的胶体金试纸条敏感性高、特异性强、稳定性好、重复性好,为DTMUV的快速检测提供了...     

抗J亚群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特异性单克隆抗体的研制及其特性

J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是一种主要感染肉用型鸡的反转录病毒。本研究用表达ALV-J囊膜蛋白基因产物的Sf9细胞免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞NS1进行融合，获得了4株特异性抗ALV-J的单克隆抗体。免疫荧光分析结果表明，3株单克隆抗体仅与所试验的ALV-J毒株反应，而不能与ALV的A、B、C、D和E亚群的毒株反应。有趣的是，有一株单克隆抗体可以与所有试验的外源性ALV毒株反应，但不与内源性的E亚群反应。Western Blot和免疫沉淀试验结果表明，单克隆抗体识别的ALV-J囊膜糖蛋白的分子量为90-94kD，识别未糖基化的囊膜蛋白分子量约为53kD。用这些单克隆抗体能检测出ALV-J病毒感染鸡胚成纤维细胞中的病毒抗原。这些结果提示这些单克隆抗体可用于ALV-J疾病的诊断和流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物的制备

以非离子去污剂Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，与新型佐剂ISCOM基质作用，应用离心和透析相结合的方法制备了猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物（PRV－ISCOMs）。PRV－ISCOMs经磷钨酸负染后电镜观察见到囊膜蛋白分布在ISCOM颗粒表面，形成直径30－40nm的笼格状结构，同时将PRV－ISCOMs在－20℃冻融5次后经电镜观察仍见到典型的笼格状结构，与国外报道的形态一致，本结果证实我们成功地制备了具有良好稳定性的PRV－IS－COMs。     

伪狂犬病病毒囊膜蛋白gD研究进展

伪狂犬病是目前危害养猪业最主要的传染病之一,虽然一些国家实施了根除计划,但在绝大多数国家,尤其是发展中国家,该病仍然频繁发生,造成的经济损失巨大,严重制约着这些国家和地区养殖业的发展。成熟的伪狂犬病病毒粒子约有50种蛋白质,包括各种糖蛋白。其中,已有10种糖蛋白被鉴定,并分别命名为gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK、gL,gM和gN。他们在病毒与细胞的相互作用,病毒感染的病理过程和免疫原性中各具特殊作用。囊膜糖蛋白gD是病毒最主要的免疫原性成分之一,在病毒的感染和增殖过程中具有重要作用。研究其基因组和蛋白结构对伪狂犬病的防控具有重要的意义。     

马动脉炎病毒大囊膜蛋白和膜蛋白基因的克隆与序列分析

参考GenBank收录的马动脉炎病毒(EAV)读码框大囊膜蛋白基因oRF5、膜蛋白基因ORF6的核苷酸序列，分别设计了2对引物，对EAV的这两种主要结构蛋白基因进行了RT—PCR；将扩增产物克隆于pUC18通用载体，对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，证实克隆片段的可靠和准确性。测序结果，ORF5目的片段包含768bp，编码255个氨基酸组成的多肽；ORF6目的片段包含489bp，编码162个氨基酸组成的多肽。与EAVNC-002532标准毒株比较，ORF5、ORF6核苷酸的同源性分别为99．1％和99．4％；推导氨基酸的同源性分剐为96．99／6和98．29／6。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法获得1株特异性针对JEV E蛋白的杂交瘤细胞,命名为5D4,经测定5D4单抗亚类属于IgG2a,轻链为κ链。经Western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体可特异地与JEV E蛋白结合。结果表明,所制备的抗JEV E蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。     

抗乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1单克隆抗体的制备与鉴定

本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2株非结构蛋白NS1作为免疫原.免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,共获得4株特异性针对JEV NS1的杂交瘤细胞,分别命名为1H6、2C3、3A7、4C8,经测定1H6单抗亚类属于IgG2b,其他3株为IgG1,轻链均为K链.4株杂交瘤细胞诱生小鼠腹水效价分别达1:20 480、1:2 560、1:20 480、1:10 240,western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体均可与JEVNS1蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验表明1H6、3A7、4C8 3株单抗能够识别天然的JEV NS1蛋白.本研究为进一步探究JEV NS1蛋白结构及其功能奠定了基础.     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39特异性单克隆抗体的制备

为了制备乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位特异性单克隆抗体,将编码乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39的DNA序列进行人工合成,随后插入表达载体pGEX-6p-1的限制性酶切位点BamHⅠ与XhoⅠ之间,构建了表位肽与GST的融合表达质粒。该表住融合蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB／c小鼠,按常规方法进行细胞融合。以化学合成的E39表位多肽为抗原,对融合细胞上清进行间接ELISA筛选。结果,筛选出1株分泌E39表位特异性抗体的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞分泌抗体能力稳定。经鉴定,该单克隆抗体亚型为IgG2b,轻链类型为κ链。结果表明,用表位融合蛋白为抗原可以制备表位特异性单克隆抗体。     

两株抗猪伪狂犬病毒的单克隆抗体制备与鉴定

采用猪伪狂犬病毒(PRV)ZJ01株纯化病毒免疫BALB/c小鼠,利用融合细胞技术和间接ELISA抗体筛选技术,制备并获得2株能稳定分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B3和5C10,其中,2B3单抗为Ig G2a亚类,5C10为Ig G1亚类,轻链均为κ链。间接免疫荧光检测结果表明,2株单克隆抗体均能与PRV发生特异性反应。Western-blot结果表明,2B3单抗针对PRV g C蛋白,5C10单抗针对PRV g E蛋白。本研究为建立快速检测伪狂犬病毒感染的免疫学方法奠定了基础。     

抗东方马脑炎病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合.以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11.Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应.利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33 (321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位.本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础.     

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

为制备基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制备了3株特异性识别HN蛋白的单克隆抗体(MAb)。其中,MAb1D4和4D9具有病毒中和活性(VN)及血凝抑制作用(HI),可以识别多种基因型的Ⅱ类NDV,但与Ⅰ类NDV病毒株无反应。MAb 2G8识别线性表位131DYIGGIGKE139,该表位在各病毒株中高度保守。获得的3株MAb可以用于NDV的鉴定及HN蛋白的功能研究。     

禽传染性喉气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gD的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达gD重组蛋白,纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,经细胞融合筛选获得一株稳定分泌抗ILTV gD蛋白的杂交瘤细胞株,MAb亚型经鉴定为IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的MAb能够识别ILTV。ILTV gD蛋白的MAb的制备,为ILTV检测方法的建立奠定了基础。     

猪源脑心肌炎病毒单克隆抗体研制与免疫学特性测定

利用纯化灭活的猪源脑心肌炎病毒(EMCV)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,研制获得4株能稳定分泌抗EMCV抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D1、2A2、2B6和4E2。经ELISA测定,细胞培养上清中抗体效价分别为1∶1 600,1∶6 400,1∶6 400和1∶3 200,小鼠腹水抗体效价分别为1∶1.63×106,1∶3.28×106,1∶1.13×106和1∶5.63×105。1D1和2A2单抗亚类为IgG1,2B6和4E2单抗亚类为IgG2b,轻链均为κ型。Western blot结果表明,1D1、2A2和4E2能特异性识别病毒的VP1蛋白,2B6能特异性识别病毒的VP2蛋白。间接免疫荧光试验证明,4株单抗具有良好的特异性,均能识别EMCV。本研究获得的4株特异性单抗,将为EMCV诊断方法的建立和病毒蛋白功能的研究奠定基础。     

抗马动脉炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗马动脉炎病毒(EAV)衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达重组N蛋白,纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,细胞融合后经间接ELISA筛选获得两株能够稳定分泌抗EAV N蛋白的杂交瘤细胞株,MAbs亚型鉴定为IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,这两株杂交瘤细胞分泌的MAb均能够识别EAV。EAV N蛋白MAb的制备,为EAV血清学检测方法的建立奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为获得猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白单克隆抗体,选择原核表达的重组gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将其脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,结果获得了2株能稳定分泌抗PRV gE蛋白的杂交瘤细胞,命名为E3B8和E5C11。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞的培养上清液抗体效价为1∶6.4×10~3,腹水的抗体效价分别达到1∶3.28×10~6和1∶6.55×10~6。2株杂交瘤细胞的染色体数分别为105和108。E3B8亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链;E5C11亚类鉴定重链为IgG2b,轻链为κ链。Western blot检测显示2株单克隆抗体腹水均能与PRV重组gE蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测显示2株单克隆抗体均能与PRV分离毒株感染的BHK-21细胞发生特异性反应,交叉反应性检测显示2株单克隆抗体与常见病毒不发生交叉反应。表明制备的2株gE蛋白单克隆抗体效价高、特异性强,为gE蛋白结构与功能分析以及PRV免疫诊断试剂盒的开发奠定了基础。