大岩桐SsKN1基因的克隆及组织表达分析

以大岩桐(Sinningia specisoa)茎尖组织为试材,采用RT-PCR方法对大岩桐SsKN1(KNOTTED1-like homeobox)基因进行克隆,经BLAST比对、邻接法构建进化树,研究了SsKN1基因与其它KNOXI基因的亲缘关系;并利用半定量RT-PCR,研究了SsKN1基因在大岩桐根、花瓣、花萼、叶、茎和茎尖等不同组织中的表达情况,以期为SsKN1基因的功能研究奠定基础。结果表明:获得了大岩桐SsKN1基因451bp的cDNA序列,该基因与烟草NTH15基因亲缘关系最近,其次为拟南芥STM基因;SsKN1基因在根、叶、茎尖和花萼等4种组织中表达,在花瓣和茎中不表达。其中在茎尖的表达量最高,叶中的表达量次之,根和花萼的表达量较低。     

鹤望兰八氢番茄红素脱氢酶基因SrPDS 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰黄色花萼中克隆到类胡萝卜素合成途径关键基因SrPDS, 该 cDNA 全长2 069 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 746 个碱基,编码581 个氨基酸。氨基酸 同源性分析表明,SrPDS 推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的PDS 蛋白具有很高的同源性。系统进 化树分析显示,鹤望兰SrPDS 与番红花首先聚为一类,其次与百合、水仙PDS 蛋白亲缘关系较近。应用 半定量PCR 分析表明,SrPDS 在黄色花萼和叶片中高表达,在蓝色花瓣和根中低表达;且在花发育的始 花期表达量最高,表明该基因在黄色花萼发育过程中起着重要作用。     

苦瓜BAG基因组织特异性表达研究

 实时荧光定量RT-PCR分析表明: 苦瓜BAG基因仅在心皮、雄蕊、花萼和幼果中表达, 花瓣中没有表达。心皮中表达水平远远高于其它组织, 为雄蕊的77倍之多; 在幼果、雄蕊和花萼中有低水平的表达。因此BAG基因直接参与苦瓜花和果实发育, 尤其对心皮的发育起着关键的作用。     

一个矮牵牛花器官发育突变体aps的表型鉴定及遗传分析

在利用矮牵牛W138株系构建突变体库的过程中,获得了一种花器官发育突变体,该突变体主要表现为花萼和花瓣发育异常,命名为aps(abnormal petals and sepals)。与正常W138植株相比,aps突变体最明显的表型是花冠开裂,通常为3裂,同时5个花萼中有2个出现部分瓣化。扫描电镜观察结果显示,突变体瓣化花萼的表皮细胞表现为正常花瓣的细胞形态。通过突变体自交、与正常姊妹株和矮牵牛W115株系杂交以及F1自交和回交等遗传分析发现,aps突变性状为单基因控制的隐性性状。q PCR分析结果表明,在突变体花萼中,3个B类基因(FBP1、PMADS1和PMADS2)和部分E类基因(FBP2、FBP4和FBP5)出现异位表达或表达量显著升高,而所有A类基因(FBP26、FBP29、PFG、AP2A、AP2B和AP2C)的表达量均明显下降,E类基因FBP9和FBP23的表达量也下调;突变体花瓣中,A类基因除FBP29不表达外,其他所有基因的表达量均显著增加,B类基因FBP1和PMADS2,E类基因FBP2、FBP5、FBP23和PMADS12的表达量上调;C类和D类基因的表达在突变体花萼和花瓣中没有明显变化,但在雄蕊和花柱中C类基因表达量明显下降,D类基因FBP7在子房中显著下调。aps突变体为研究矮牵牛花器官发育的调控机制及相关基因之间的调控关系提供了良好的材料。     

黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

 以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1 011 bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2 h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12 h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4 h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

辣椒高赖氨酸蛋白基因Cflr全长cDNA的克隆及其组织表达特征

为了在茄科植物中寻找新的高赖氨酸蛋白基因,以辣椒栽培种‘江蔬7号'的成熟花粉为材料,根据马铃薯和番茄中高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增到一条长390 bp的cDNA片段,继而应用RACE技术克隆了一个辣椒高赖氨酸蛋白基因的全长cDNA,命名为Cflr（GenBank登录号：EU367999）。Cflr基因cDNA全长920 bp,5＇端有84 bp的非翻译区,3＇端具有完整的polyA尾,包含一个编码223个氨基酸的完整开放阅读框。Cflr基因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白基因cDNA序列的同源性为50%～60%,氨基酸序列的同源性为40%～50%。该基因所编码的蛋白质中赖氨酸含量为21.2%,苏氨酸含量为10.3%,是目前已知赖氨酸含量最高的天然蛋白。半定量RT-PCR结果表明,Cflr基因在辣椒未成熟花药、成熟花粉、花瓣、茎、叶片和根中均有表达,在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最高,在叶片中表达量明显减少,而在未成熟花药、茎和根中的表达量极少。     

洋葱花发育B类MADS-box基因AcDEF的克隆与表达分析

 以紫皮洋葱常规品种‘RUPI’为试材,通过RACE方法克隆了AP3/DEF同源基因AcDEF,并用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR研究AcDEF在洋葱各类器官中的表达模式。GenBank登录号为JX661502的AcDEF基因长1 014 bp,开放阅读框长度为675 bp,编码224个氨基酸。系统发育分析表明,AcDEF基因属于单子叶B功能基因家族的AP3/DEF亚家族。表达模式分析显示,AcDEF在花器官中特异表达,其中在花瓣、雄蕊内高丰度表达,在花葶和膜状总苞中微量表达,在心皮中表达水平极低,在无性营养器官如根、假茎、叶片和鳞茎中无表达。在开花过程中,各花器官中AcDEF转录物的积累呈动态变化;在花瓣和雄蕊发育过程中AcDEF均高丰度表达,但在完全开放花的花瓣和雄蕊中表达量略有降低;在花葶、膜状总苞和心皮中表达量递减,在完全开放花的膜状总苞和心皮中AcDEFAcDEF基因的序列结构和表达模式具有单子叶物种AP3/DEF基因的特征,属于paleoAP3进化系。的表达量很低。     

黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1011bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

大岩桐花萼和幼叶转录组研究

利用新一代高通量测序技术平台Illumina Solexa GAⅡx对大岩桐花萼和幼叶进行转录组测序和数据从头组装及生物信息学分析,获得了长度大于100 bp的转录物22 821条;转录本总长度28.63 Mb,N50长度1 548 bp,序列平均长度953 bp。转录物注释结果显示,15 053条有同源比对信息;7 768 条无匹配序列信息,可能为大岩桐特有的基因序列。通过对花萼、幼叶中与激素代谢、信号转导相关的差异KEGG通路比较,推断在花萼中促进生长激素合成基因的表达比幼叶中强,激素信号转导组分基因的表达也比幼叶中强。     

草莓NBS—LRR家族基因FaNBS1的克隆与表达分析

利用同源克隆结合RACE技术从久香草莓茎尖cDNA中分离到一个抗病相关TIR-NBS-LRR类基因FaNBS1（GenBank登录号：HQ845018），解析了该基因及其编码蛋白的组织结构和同源特征；并采用半定量RT-PCR技术分析了该基因在不同组织中的表达差异和外源植物生长物质处理下的表达变化。该基因在基因组上长为2...     

辣椒高赖氨酸蛋白基因Cflr全长cDNA的克隆及其组织表达特征

为了在茄科植物中寻找新的高赖氨酸蛋白基因,以辣椒栽培种‘江蔬7号'的成熟花粉为材料,根据马铃薯和番茄中高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增到一条长390 bp的cDNA片段,继而应用RACE技术克隆了一个辣椒高赖氨酸蛋白基因的全长cDNA,命名为Cflr（GenBank登录号：EU367999）。Cflr基因cDNA全长920 bp,5＇端有84 bp的非翻译区,3＇端具有完整的polyA尾,包含一个编码223个氨基酸的完整开放阅读框。Cflr基因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白基因cDNA序列的同源性为50%～60%,氨基酸序列的同源性为40%～50%。该基因所编码的蛋白质中赖氨酸含量为21.2%,苏氨酸含量为10.3%,是目前已知赖氨酸含量最高的天然蛋白。半定量RT-PCR结果表明,Cflr基因在辣椒未成熟花药、成熟花粉、花瓣、茎、叶片和根中均有表达,在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最高,在叶片中表达量明显减少,而在未成熟花药、茎和根中的表达量极少。     

辣椒细胞质雄性不育相关基因的克隆与表达分析

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应保持系21B为试材,根据辣椒细胞质雄性不育相关基因orf456序列设计特异引物,对21A及21B的基因组DNA进行特异性扩增,获得了不育系特有的目的条带,克隆测序表明其大小为292bp,命名为CMS292。采用QRT-PCR方法,研究了CMS292分别在蕾期、盛花期对根、茎、叶和花蕾中的表达水平的影响,以期探索雄性不育相关基因的表达机制。结果表明:该基因只在不育系中表达,并且在所检测的组织中都有表达;蕾期根和花蕾中的表达量明显高于茎和叶,盛花期根和叶中的表达量高于茎和花蕾;从蕾期到盛花期根、茎和花蕾中的表达量呈下降趋势,而叶中的表达量呈上升趋势,推测CMS292控制辣椒花药中蛋白的表达,引起小孢子败育,进而导致雄性不育。     

桂花DAD-1基因克隆与表达分析

以"柳叶金桂"桂花(Osmanthus fragrans‘Liuye Jingui’)为试材,采用TAIL-PCR技术,克隆了"柳叶金桂"花瓣中DAD-1基因的全长序列,并分析了其在桂花不同组织部位及开花阶段的时空表达模式,以期为研究该基因在桂花花瓣衰老过程中的功能提供参考依据。结果表明:DAD-1基因由560个碱基组成,包含一个351bp的完整开放阅读框和一个3′-Poly A尾巴;DAD-1基因编码的蛋白包含116个氨基酸,其结构预测表明DAD-1蛋白属于疏水性膜整合蛋白,通过3个α?螺旋构成的跨膜区行使功能。半定量PCR结果表明,该基因在"柳叶金桂"的根、茎、叶、花等各组织器官中均有表达,且在花苞、新叶等幼嫩组织器官中相对表达量较高,在老叶等成熟组织器官中相对表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在"柳叶金桂"花瓣衰老过程中,DAD-1基因在铃梗期开始显著下调表达。     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。     

菊花花瓣伸长相关基因CmXTHs的克隆与功能验证

从杭白菊(Chrysanthemum morifolium‘Hangbaiju’)中克隆了4个细胞壁松弛和伸展相关的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因,分别命名为CmXTH1、CmXTH2、CmXTH3和CmXTH4,序列分析表明其编码的氨基酸序列N端都含有23~30个氨基酸组成的信号肽区域和保守的催化活性位点DE(I/L)DEFLG以及紧邻的N(R/A)T组成的N端糖基化位点,CmXTH1/2/3的C端均含有4个保守的半胱氨酸残基,CmXTH1/2/3/4蛋白的相似度为66.2%。系统进化分析结果表明,CmXTH1/2/3属于XTH家族Ⅰ组,CmXTH4属于Ⅱ组。实时荧光定量结果表明:(1)菊花CmXTH1/2/3/4在根、茎、叶和花蕾中均有表达。CmXTH1在根中表达量较高,CmXTH2/3在茎中表达量较高,CmXTH4在花蕾中表达量最高。(2)CmXTH1/2/3/4在花序不同部位表达量有差异,CmXTH1/4在舌状花中表达量最高,CmXTH2/3在筒状花中表达量较高。(3)CmXTH1/2/3/4在舌状花不同发育阶段表达量差异显著,CmXTH1/2在盛花期表达量最高,CmXTH3在衰老期表达量最高,CmXTH4在初开期表达量最高。病毒诱导基因沉默结果表明,CmXTH1/2/3/4沉默系的花序直径和舌状花长度与对照相比均有所减小,其中CmXTH4沉默系减小最大,分别减小了25.67%和10.42%,舌状花花瓣表皮细胞与对照相比明显变小,影响了舌状花花瓣的伸长;CmXTH2沉默系的筒状花雄蕊长度和CmXTH4沉默系的花萼直径分别与对照相比显著减小。这表明菊花CmXTH1/2/3/4基因参与了花序的开放,促进了舌状花花瓣的伸长,对于菊花的花序增大具有重要作用。     

野生毛葡萄水通道蛋白基因VhPIPs的克隆与组织特异性表达研究

从野生毛葡萄组织中克隆了9个质膜水通道蛋白基因（VhPIP）的cDNA全长序列,并研究了其生物信息学特征及组织特异性表达。氨基酸序列分析表明,9个VhPIP分为PIP1和PIP2两类;均含有MIP蛋白家族保守的信号序列SGGHINPAVT和两个NPA（Asn-Pro-Ala）单元,均为稳定性蛋白、疏水性蛋白,且每个VhPIP均含有6个跨膜区。实时荧光定量RT-PCR分析表明,这9个VhPIP在抗旱的毛葡萄‘花溪–9’根、茎、叶中均有表达,其中VhPIP1;1、VhPIP1;2、VhPIP1;4、VhPIP2;1、VhPIP2;2和VhPIP2;4在其根中的表达量最多,可能与根部水分运输的调节密切相关;VhPIP1;5和VhPIP2;3在其叶中的表达量最多,可能主要参与叶片的水分运输,与叶片的蒸腾作用密切相关;VhPIP1;3在根、茎和叶中的表达量无显著性差异;相对于其他基因的表达,VhPIP1;1和VhPIP2;4在根中表达量最高,这两个基因可能在水分运输过程中起较大作用。     

草莓不同器官中microRNA表达差异研究

MicroRNA(miRNA)在植物的生长发育过程中起着重要作用。以CTAB法提取的总RNA为模板,通过设计茎环反转录引物,利用实时RT-PCR技术对草莓根系、花托、茎尖和叶片4种器官中的6种miRNA进行了表达差异研究。以草莓叶片中6种miRNA的表达量为1,差异表达结果显示miR164在草莓花托中高度表达,达到6.615,明显高于根系(0.485)、茎尖(0.371)和叶片(1.000);miR172在茎尖和花托中的表达量都较低,分别为0.029和0.020,在根系中的表达量更低,只有0.0008454;miR167在根系中表达也很低,只有0.053;miR156,miR159和miR165在4种草莓器官中的表达差异不明显。这些结果为进一步验证miRNA基因在草莓植株生长发育过程中的作用奠定了基础。     

月季（Rosa chinensis）丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及其表达分析

 根据GenBank 发表的丁香酚合成酶（EGS）基因的蛋白保守序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE-PCR 技术,从古老月季（Rosa chinensis）品种‘月月粉’盛开期的花瓣中获得了1 个新的丁香酚合成酶基因RcEGS1,GenBank 登录号为JQ522949。该基因全长为1 171 bp,开放阅读框（ORF）951bp,编码317 个氨基酸;蛋白质理论分子量为35.64 kD,等电点为7.36。氨基酸同源性分析表明,RcEGS1与矮牵牛PhIGS1 的氨基酸同源性达到70%,与罗勒ObEGS1 的同源性为59%,与月季RhEGS1 的同源性仅为48.2%。运用实时荧光定量PCR 法分析RcEGS1 在不同组织部位和不同开放时期花瓣中的表达,发现其在叶片和茎段中没有表达,在花瓣和萼片中有表达,在盛开期的花瓣中表达量最高。     

湖北海棠MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分析

 为了分析WRKY40抗病抗逆作用,以湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp）Rehd.]为试材,利用特异引物进行RT-PCR基因克隆,利用实时荧光定量PCR方法分析组织中基因的表达及低温、高盐、干旱、PEG6000胁迫和外源IAA、ABA处理对基因表达的影响。结果表明,克隆到的片段长度为1 240 bp,包含一个完整的开放阅读框,长999 bp,编码333个氨基酸。该基因与拟南芥AtWRKY40同源,故命名为MhWRKY40b,GenBank登录号为JX112913。基因表达分析表明,MhWRKY40b在根、茎、叶等组织均有表达,其中在花萼、花辨、果实中表达量较高。该基因明显受低温、高盐、干旱胁迫诱导表达,最高相对表达量可达20倍以上;而受PEG、苹果白粉病菌及外源ABA和IAA轻微诱导,最高相对表达量在10倍以下。MhWRKY40b除了在抗白粉病方面与AtWRKY40具有相似功能外,可能还在湖北海棠的抗寒、抗盐、抗旱过程中起到比较重要的作用。     

乙烯利诱导菠萝成花过程中FT基因的克隆与表达分析

【目的】克隆菠萝AcFT基因并研究其表达模式,为深入研究该基因在乙烯利诱导菠萝成花中的功能奠定基础。【方法】从菠萝基因组数据库中获得AcFT基因全长序列,设计全长引物,克隆两个AcFT基因,分别命名为AcFT1和AcFT2,对基因序列进行生物信息学分析;通过qRT-PCR探究乙烯利处理后菠萝AcFT基因在不同组织、时间下的表达模式。【结果】AcFT1和AcFT2分别编码178和177个氨基酸,两者均含有PBP结构域,具有PEBP家族典型结构特征。实时荧光定量PCR分析结果显示,AcFT1和AcFT2都具有组织表达特异性,在茎和叶中相对表达量较高;乙烯利处理后,AcFT1和AcFT2在茎和叶中的表达具有相反的趋势,其中AcFT2明显受到乙烯利上调,呈现先上升后下降趋势,AcFT1则显示为先下降后上升。乙烯利处理后1 d,茎尖组织AcFT2的表达水平显著上升,相对表达量约为对照的178倍,而AcFT1则明显下调;乙烯利处理后31 d,AcFT2在茎尖中的表达水平达到最大值,约为对照的408倍,但AcFT1却处于极低水平。【结论】克隆得到2个AcFT基因,AcFT2基因在乙烯利处理后1 d及随后的花芽分化时期高度表达,表明AcFT2在响应外源乙烯利信号诱导菠萝成花过程中发挥重要作用。