不同因素对猪卵母细胞体外成熟影响的研究进展

猪卵母细胞的体外成熟率与其他的哺乳动物相比不够理想,因为卵母细胞的成熟发育是一个极其复杂的过程,影响的因素非常多。主要分为物理因素、化学因素两大类,而卵丘卵母细胞(COCs)的凋亡无疑也是影响卵母细胞体外成熟的重要因素。本文就这几方面作一综述。     

细鳞鱼卵巢滤泡细胞的发育及功能

通过光镜和透射电镜对细鳞鱼（Brachymystax lenok）的卵巢滤泡细胞进行了研究。结果表明,滤泡细胞起源于非生殖细胞,并且其整个发育过程可分为4个时期：零散细胞期、单层扁平细胞期、多层扁平细胞期和颗粒细胞分泌期。滤泡细胞在初级卵母细胞早期并不具备任何功能,到卵母细胞卵黄积累初期,滤泡细胞上皮协同其合成部分卵膜;卵黄积累旺盛时期,滤泡细胞在此过程中起到信号介导、物质转运和储存的作用;在卵巢退化阶段,滤泡细胞与未发育的卵母细胞形成闭锁卵泡,对卵细胞残体和碎片还具有吞噬、消化等作用。     

促性腺激素调控半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞孕酮受体膜组分1的表达特征

采用qRT-PCR方法分析性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同发育时期卵巢卵母细胞的孕酮受体膜组分1 (PGRMC1)mRNA的表达,研究发现,在发育Ⅳ期的卵巢,处于第Ⅳ时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P＜0.05);在发育Ⅴ期的卵巢,成熟期卵母细胞的PGRMC1mRNA表达量最高(P＜0.05).采用不同浓度促性腺激素(HCG)处理卵巢发育Ⅴ期半滑舌鳎不同时相的卵母细胞,并通过qRT-PCR和Western blotting技术对其表达量变化进行检测.结果显示,20IU/mlHCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10 IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系.HCG对半滑舌鳎不同时相的卵母细胞的调控作用效果不同,对第Ⅴ时相卵母细胞作用最明显(P＜0.05),表明PGRMC1主要在卵母细胞成熟阶段发挥作用.PGRMC1对HCG调控作用的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供重要基础资料.     

促性腺激素调控半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞孕酮受体膜组分1的表达特征

采用qRT-PCR方法分析性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同发育时期卵巢卵母细胞的孕酮受体膜组分1(PGRMC1)mRNA的表达,研究发现,在发育Ⅳ期的卵巢,处于第Ⅳ时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P0.05);在发育Ⅴ期的卵巢,成熟期卵母细胞的PGRMC1 mRNA表达量最高(P0.05)。采用不同浓度促性腺激素(HCG)处理卵巢发育Ⅴ期半滑舌鳎不同时相的卵母细胞,并通过q RT-PCR和Western blotting技术对其表达量变化进行检测。结果显示,20 IU/ml HCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10 IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系。HCG对半滑舌鳎不同时相的卵母细胞的调控作用效果不同,对第Ⅴ时相卵母细胞作用最明显(P0.05),表明PGRMC1主要在卵母细胞成熟阶段发挥作用。PGRMC1对HCG调控作用的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供重要基础资料。     

细胞凋亡的分子机理及其检测方法研究进展

细胞凋亡（apoptosis）是细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后一种主动的、由一些凋亡相关基因相互作用的细胞消亡过程。凋亡的发生具有积极的生物学意义，是维持机体内环境稳定所必需。细胞凋亡与有丝分裂相互协调，共同控制胚胎发育、器官的发育与退化以及免疫、造血等生理过程。     

Caspase-3在黄鳝性腺性逆转过程中的表达及定位分析

为探究黄鳝( Monopterus albus )Caspase-3在性腺性逆转发育过程中的功能和作用,实验扩增黄鳝 caspase-3 的部分序列,检测了其在不同发育时期性腺中mRNA表达水平、蛋白相对含量以及表达位置。通过PCR扩增获得黄鳝 caspase-3 基因cDNA序列,推导的氨基酸序列对比发现,黄鳝 caspase-3 与大黄鱼( Larimichthys crocea )和鳜( Siniperca chuatsi )亲缘关系最近。实时定量PCR ( qRT-PCR)结果显示, caspase-3 mRNA在黄鳝各发育时期性腺中均有表达,在卵黄生成期性腺中表达量最高,并伴随性腺向雄性发育表达量呈下降的趋势;而其蛋白相对含量在性腺性逆转过程中呈现逐渐上升的趋势,间性晚期最高。免疫组织化学染色结果显示,Caspase-3蛋白阳性信号定位于卵黄生成期卵母细胞细胞质、皮质小泡期卵母细胞的细胞核和颗粒细胞,以及各个发育时期性腺中初级生长期卵母细胞的细胞质和细胞核。综上,Caspase-3与黄鳝性逆转过程关系密切,推测其可能参与了性逆转过程中卵母细胞的凋亡过程。     

斑节对虾细胞周期蛋白B慢病毒载体的构建及对Hela细胞增殖影响

细胞周期蛋白B（Cyclin B）是影响卵母细胞发育成熟的重要基因。文章构建了PmCyB慢病毒表达载体,并和慢病毒包装复合物在293T细胞中包装成慢病毒颗粒。利用包装好的慢病毒颗粒,感染干扰了Cyclin B1基因的Hela细胞,研究了PmCyB对Hela细胞增殖的影响。结果表明,通过siRNA干扰细胞自身的Cyclin B1后,转染对照组病毒液的Hela细胞增殖减缓;同时,干扰后转入含有PmCyB重组慢病毒表达载体,Hela细胞增殖速度明显要高于转染对照组病毒液的Hela细胞的增殖速度。这一结果表明,PmCyB基因的过表达能补偿Cyclin B1缺失导致的细胞增殖减缓的现象,说明PmCyB基因具有细胞周期调控功能,是细胞增殖与分化的重要调控基因,且功能可能与人类的Cyclin B1相似。人类的Cyclin B1是卵母细胞发育成熟的重要基因。由此可以推断,PmCyB基因可能对斑节对虾（Penaeus monodon）卵巢发育成熟起着重要作用。     

细胞凋亡的分子机理及其检测方法研究进展

细胞凋亡(apoptosis)是细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后一种主动的、由一些凋亡相关基因相互作用的细胞消亡过程.凋亡的发生具有积极的生物学意义,是维持机体内环境稳定所必需.细胞凋亡与有丝分裂相互协调,共同控制胚胎发育、器官的发育与退化以及免疫、造血等生理过程.     

兴凯湖翘嘴鲌的卵巢发育和胚胎发育

正1兴凯湖翘嘴鲌卵巢发育刘筠(1993)以鱼类卵巢本身的组织学特征为基础,并综合细胞形态学和生理学理论进行时期划分。即以卵细胞的成熟等级或时相为标准,把卵巢分为6个时期。并按卵细胞概念的适用范围:卵原细胞、初级卵母细胞、成熟卵母细胞和退化卵母细胞,并将卵细胞区分为6     

曼氏无针乌贼的卵子发生及卵巢发育

采用组织学方法对人工养殖曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)卵子发生、卵巢发育周期进行组织学、细胞学观察。根据细胞大小、胞核形态及卵母细胞与滤泡细胞的关系,将曼氏无针乌贼卵子发生划分为卵原细胞期、卵母细胞期、成熟期和退化吸收期4个阶段,并阐述了各期卵母细胞的组织学特征。曼氏无针乌贼卵子发生过程具有种的特异性,大约孵化出膜12 d的乌贼可见有卵原细胞,此后进入增殖期。卵母细胞属于典型的滤泡型,发育过程中同时存在同步性与异同步性;卵母细胞无初级卵膜,只有次级卵膜和三级卵膜,次级卵膜由滤泡细胞分泌,三级卵膜由输卵管腺、缠卵腺以及墨囊分泌物共同构成。通过对卵巢的外观形态和组织学观察,将曼氏无针乌贼卵巢发育划分为6个时期。     

哺乳动物黄体溶解的调控

黄体溶解的机理目前仍不十分清楚,已证实细胞凋亡在黄体溶解中起重要作用。激素和包括细胞因子在内的一些卵巢局部因子通过内分泌、自分泌和／或旁分泌方式参与了黄体细胞凋亡的调控,一些调节基因也参与了此过程一在生理情况下,它们之间可能存在着“激素－卵巢局部因子－基因”这样一个相互影响的级联调控机制,影响着黄体机能＿     

光裸星虫SERCA基因克隆及在卵母细胞中的表达分析

细胞内钙离子(Ca²⁺)浓度的变化是介导卵母细胞成熟的重要因素。肌质网/内质网Ca²⁺-ATP酶(Sarco/endoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase, SERCA)属P型ATP酶家族成员,是细胞内Ca²⁺转运的重要调控蛋白。前期转录组分析显示,光裸星虫(Sipunculus nudus) SERCA (Sn-SERCA)的表达量在卵母细胞发育过程中差异显著,为进一步研究SERCA在卵母细胞不同发育阶段中的作用,利用RACE技术得到Sn-SERCA cDNA全长,采用实时荧光定量PCR检测SnSERCA在各卵母细胞发育时期的相对表达量。结果表明,Sn-SERCA全长为3 840 bp,5’非编码区(UTR)为196 bp,3’UTR为581 bp,开放阅读框3 060 bp,编码1 020个氨基酸,Sn-SERCA具有P型ATP酶家族进行催化反应所需的两个保守基序“TGES”和“DKTGT”。多序列比对、Motif分析及三级结构预测结果显示SERCA同源...     

太平洋牡蛎二倍体和三倍体卵母细胞发育的超微结构

本文利用电子显微镜比较研究了太平洋牡蛎二倍体和三倍体卵母细胞发育过程中细胞和各细胞器的超微结构变化。结果表明,在卵黄形成期,二倍体卵母细胞呈椭圆形,细胞器发达,细胞外布满微绒毛,卵黄粒多并均匀分布于细胞质中,卵母细胞生物合成旺盛,代谢活动强;而三倍体卵母细胞呈长条形或不规则形,细胞器少,不发达,细胞外未观察到微绒毛,卵黄粒少,有些细胞的卵黄粒畸形,卵母细胞生物合成及代谢弱。     

半滑舌鳎卵巢发育的组织学和形态数量特征研究

采用组织学方法系统研究了人工养殖条件下半滑舌鳎亲鱼卵巢的组织发育周年变化特征.结果表明,卵母细胞发育可分为6个时相,卵巢发育分为6期.卵巢不同发育时期都由不同类型的卵母细胞组成,半滑舌鳎为非同步分批多次产卵类型.周年发育过程中,6月龄前的鱼卵巢发育处于第Ⅰ期;9～12月龄卵巢可发育至第Ⅱ期;12月龄半滑舌鳎性腺可发育达到Ⅲ期,并一直保持至24月龄.3龄雌鱼达到性成熟,卵巢可发育至第Ⅳ期;随着水温和光周期的调控,卵巢发育进入成熟期(Ⅴ期),发生水合现象是卵母细胞成熟并准备排卵的信号;产卵结束后卵巢退化至第Ⅵ期,排出的卵母细胞退化吸收,以Ⅲ期卵巢越冬后,卵巢退化至Ⅱ期并持续至下一个繁殖周期.人工养殖条件下,卵巢内存在卵母细胞闭锁现象.性腺周年发育过程中,性腺指数(GSI)在性腺达到成熟期时达到峰值,产卵结束后性腺快速退化,GSI值各月份差异显著(P<0.05),亲鱼性腺重量在卵巢发育成熟过程中一直处于生长状态.亲鱼肝脏指数(HSI)在产卵前7～8月份(性腺达到成熟期前30 d左右)达到最大,表明7～8月份是性腺进行卵子发育、卵黄能量储备的重要时期,亲鱼在产卵前通过积极摄食储备体内能量,肝脏在卵母细胞卵黄积累方面具有重要的生理作用.肥满度(CF)值在繁殖盛期10～11月份达到最大,表现出与GSI类似的变化趋势.     

低温对四川华鳊卵巢发育的影响及调控

四川华鳊（Sinibrama taeniatus）是长江上游特有的小型经济鱼类,在野外其一年可以繁殖两次,但在26℃条件下进行人工养殖时其繁殖周期仅为14天,其中低温是限制其在野外繁殖的重要因素。为探究低温对四川华鳊卵巢发育的影响及调控方式,本研究对其产卵后雌鱼进行11℃的低温处理（LT组）,并与26℃条件下（OT组）卵巢发育状况进行对比。通过形态学和组织学观察发现LT组卵巢发育被抑制,发生退化,卵母细胞明显发育不良,出现典型闭锁卵泡的特征。对雌鱼血清中部分生殖激素及卵巢中相应受体基因的表达水平进行测定,发现低温使FSH和DHP水平显著下降,并严重抑制激素受体基因fshr,lhcgr,pgr,esr1,ar的表达。通过转录组测序和分析发现,在低温处理过程中类固醇激素合成,细胞生长增殖以及凋亡和自噬相关通路被显著富集,与低温的影响显著相关。低温下调了类固醇激素合成和卵母细胞发育相关基因StAR,cyp17a1,hsd3b,cyp19a2,hsd17b1,vtg1,zp4,mmp9,mmp15以及细胞生长增殖和抗凋亡相关基因ccni,cdk16,igf1r,egfr,nobox,bcl2的表达,上调了促凋亡基因bax,tnf,tp53的表达。上述结果表明,低温导致卵泡闭锁的原因一方面可能是低温抑制生殖激素的合成和受体基因的表达,使卵巢发育和卵母细胞生长增殖受限;另一方面,可能是低温促使卵泡发生自噬凋亡,最终导致卵泡发生退化闭锁。     

光裸星虫Hsp90基因的全长克隆及其在全组织和卵母细胞中的表达分析

热休克蛋白Hsp90在蛋白质正确折叠、胞内物质运输、细胞增殖调控、配子发生等过程中发挥重要的作用。本研究利用RACE技术克隆获得了光裸星虫热休克蛋白Hsp90 (SnHsp90) cDNA全长序列。SnHsp90全长3110 bp,其中,3´UTR为582 bp,5´UTR为72 bp,开放阅读框为2456 bp,编码818个氨基酸。序列分析结果显示,SnHsp90蛋白具有1个信号肽,存在B型Hsp90的3个标签序列FLREL、IGQFGVGFYS、LPLNVSRE以及保守模块GxxGxG,表明SnHsp90属于Hsp90B亚族。与其他物种的Hsp90氨基酸序列比对发现,SnHsp90与鸭嘴海豆芽(Lingula anatine) Hsp90相似度最高,为77.72%。三维结构建模发现,Hsp90在不同物种之间的空间构象具有较高保守性。系统进化树分析显示,SnHsp90先与小头虫(Capitella teleta)、水蛭(Helobdella robusta)等环节动物的Hsp90聚为一支,再与鸭嘴海豆芽等其他无脊椎动物聚为一大支,而脊椎动物聚为另一大支,表明SnHsp90与小头虫Hsp90亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,SnHsp90在光裸星虫的体壁、收吻肌、肾管等组织中均有表达。SnHsp90也可在卵母细胞不同发育时期表达,其中,在卵黄旺盛合成前期(Egg2)和外排卵母细胞期(Egg6)显著高表达(P<0.05),暗示,SnHsp90可能参与到光裸星虫卵母细胞的蛋白质正确折叠、卵黄合成与环境抗逆等过程。研究结果为进一步探究光裸星虫卵母细胞发育的分子机制积累了基础资料。     

中华锯齿米虾卵子发生过程中滤泡细胞的结构研究

利用光镜和透射电镜对中华锯齿米虾卵子发生过程中滤泡细胞的结构进行了研究。结果表明:随着卵子发生,滤泡细胞经历了发生、发育及退化的过程。在卵黄大量生成阶段,单层滤泡细胞紧贴卵母细胞,其内部蕴含着大量的内质网及线粒体。滤泡细胞与卵母细胞通过微胞饮泡和微绒毛进行物质交换。     

克氏原螯虾不同发育时期5-HT与DA在卵巢和肝胰腺中的分布

为了研究5-HT与DA阳性物质在克氏原螯虾(Procambrus clarkii)不同发育时期的卵巢细胞和肝胰腺细胞中的分布特征,运用免疫组化法对卵巢发育4个不同时期的卵巢与肝胰腺进行观察。结果表明,各期卵巢卵细胞和肝胰腺细胞中均存在5-HT与DA阳性物质。Ⅰ期卵巢5-HT阳性物质分布于卵母细胞胞核,胞质未出现阳性;Ⅱ期～Ⅳ期5-HT阳性物质主要集中在卵母细胞胞质以及胞核。在发育各期的肝胰腺中5-HT的免疫物质均呈阳性。Ⅰ～Ⅳ期卵巢中,DA阳性物质主要分布于卵母细胞的胞核以及肝胰腺细胞,其强度呈递减趋势。结果提示5-HT具有促进卵巢发育作用,而DA则抑制卵巢发育。     

MiR-155靶向踝蛋白调控柱状黄杆菌胞外多糖诱导的EPC细胞凋亡

柱状黄杆菌胞外多糖 (FC-EPS) 孵育能显著提高鲤上皮瘤细胞 (EPC) 中 miR-155 的表达,导致细胞发生凋亡。为研究 miR-155 在 FC-EPS 诱导的细胞凋亡中的作用机制,本文采用 RNAi 技术,通过过表达 miR-155 和敲降踝蛋白 (talin-1),皆能抑制 FC-EPS 诱导的细胞凋亡,并鉴定出 talin-1 为 miR-155 的靶蛋白。在 FC-EPS 诱导细胞凋亡的过程中,踝蛋白水平显著升高,在凋亡发生阶段检测到凋亡执行蛋白 caspase-3 的活化,同时检测到两条踝蛋白剪切异构体,大小约为200 kDa 和 250 kDa;将构建的鲤 talin-1 真核表达质粒转染 EPC 细胞,过表达的 talin-1 延迟且延长了细胞凋亡的进程,并检测到上述两条踝蛋白异构体。然而,当以 FC-EPS 转染 EPC 细胞时,talin-1 先下降再恢复到正常水平,细胞不发生凋亡。因此,在 FC-EPS 诱导细胞凋亡的过程中,细胞通过上调 miR-155 来调控靶基因 talin-1 mRNA 和蛋白转录的变化,以及产生 talin-1 蛋白异构体来抑制细胞发生凋亡。本文为有效防治柱状黄杆菌疾病提供新思路。     

莱氏拟乌贼卵子发生的组织学观察

2020年8月在福建海域用底拖网捕获雌莱氏拟乌贼Sepioteuthis lessoniana 7尾，未性成熟个体2尾，平均体质量（210±43）g，已性成熟个体5尾，平均体质量为（430±76）g，用组织切片技术观察其卵巢的显微组织学结构，根据卵子的发生特征和变化规律划分卵子发生时期。结果显示：莱氏拟乌贼卵巢内的卵原细胞个体逐渐增大，细胞核由中央偏向一端直至消失；扁平状滤泡细胞和椭圆形滤泡细胞先后包裹卵母细胞，双层滤泡细胞在卵母细胞内增多并形成指状突起；卵黄物质在滤泡细胞解体时形成，最终充满卵母细胞。根据以上特征，将莱氏拟乌贼的卵子发生划分为4个阶段9个时期，即第一阶段卵原细胞期，第二阶段无滤泡细胞期、单层滤泡细胞期和双层滤泡细胞期，第三阶段滤泡细胞增生初期、滤泡细胞增生中期和滤泡细胞增生末期，第四阶段卵黄堆积期及成熟期。本研究认为莱氏拟乌贼卵子内的滤泡细胞起到合成并分泌营养物质的功能。