鸭瘟病毒提纯方法比较

将鸭瘟病毒CHv株经鸭胚和鸭胚成纤维细胞(DEF)进行培养增殖后,收集病毒液,分别采用沉淀法、层析法、差速离心法和蔗糖不连续密度梯度离心法进行了鸭瘟病毒的提纯研究,结果表明,DEF增殖与蔗糖不连续密度梯度超速离心法是鸭瘟病毒较好的增殖和提纯方法,病毒粒子主要存在于400～500g·L-1蔗糖层上;经20g·L-1磷钨酸负染后电镜观察发现,提纯病毒具典型疱疹病毒特征,大小较一致,为170～190nm,由核芯、衣壳和囊膜3部分组成结构较完整的病毒粒子;采用Bradford法测定,纯化病毒液中病毒含量为0.71mg·mL-1.     

玉米矮花叶病毒特性及受侵叶片的超微结构

对玉米矮花叶病毒的病毒粒子形态、结构及其特性，感病叶片的超微结构进行了初步的研究。提纯病毒研究结果表明，MDMV粒子形态为线状，宽度为14nm，长度不等，完整粒子长度为720～750nm。病毒悬浮液经紫外扫描获得了典型的核蛋白紫外吸收光谱，最高吸收峰在257．5nm，最低峰在243．3nm，O．D280/O．D260约为0．73。在电镜下观察感病叶片的超微结构，可在细胞质内观察到大量的病毒粒子及风轮状、柱状内含体，体现了马铃薯Y病毒组的典型特征。同时，在感病组织内还可看到许多破坏的叶绿体、线粒体等。     

水稻条纹叶枯病的研究 Ⅲ.病害的病原性质

水稻条纹叶枯病系由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)所致.病毒由灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久性方式并经卵传播,介体灰飞虱有明显的间歇传毒现象.提纯病毒制剂具有典型的核蛋白紫外吸收曲线,最大吸收260nm,最小吸收245nm,A260/280=1.54.病毒粒体长丝状,粒体直径约8nm,与日本的水稻条纹病毒抗血清呈阳性反应.将提纯病毒制剂免疫家兔制备抗血清,其效价可达1∶2048.采用该抗血清,通过免疫扩散和ELISA间接法反应,可很灵敏地检测病叶中的RSV.     

一种改进的对虾白斑综合征病毒提纯方法

对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白在提纯的过程中易脱落,用传统的密度梯度离心方法不易获得完整的病毒粒子,对传统的蔗糖密度梯度离心方法加以改进后,可以获得大量完整的病毒粒子.用患白斑综合征病毒病的中国对虾鳃制备WSSV粗提液,感染螯虾(Cambarus proclarkii),选取25%的蔗糖溶液用作病虾鳃的匀浆液,然后经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,大量完整的病毒位于46% ～52% 蔗糖梯度之间,病毒粒子末端带有很长的尾;而病毒裸露的核衣壳位于40%～46%蔗糖梯度之间;在57%～62%之间观察到较多完整病毒粒子和少量细菌.实验结果表明改进的病毒提纯方法较好,可得到大量完整的带嚢膜的病毒颗粒.     

水稻簇矮病毒的提纯及其性质

 采用差速离心和蔗糖密度梯度离心，可获得水稻簇矮病毒（RBSV）提纯制剂。提纯制剂经紫外扫描，呈典型的核蛋白吸收曲线，A260/240=1.18，A260/280=1.61。在电镜下观察提纯病毒，可见大量比较均一的球状粒体，直径为60.0nm。病毒粒体有双层衣壳，蛋白亚基清晰可辨。通过免疫扩散和免疫电镜试验，病毒粒体与自制的RBSV抗血清有明显的血清学反应，而这种抗血清与水稻矮缩病毒(RDV)、水稻瘤矮病毒(RGDV)不起反应。提纯病毒制剂以苯酚-甲基苯酚-SDS方法提取核酸。将其注射到介体昆虫内，具有侵染性。核酸制品有典型的核酸紫外吸收曲线，A260/228=2.27，A260/280=2.02。根据核酸在不同离子强度下对RNase的稳定性等的测定，表明其核酸属双链RNA。根据紫外吸收测定，RNA在RBSV粒体中的含量为17.5%-20.1%。用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其RNA的总分子量为16.66×10#+(6)d，含组分分子量为2.70、2.30、1.90、1.70、1.68、1.50、1.38、1.20、1.10、0.60、0.35、和0.25(× 10#+6)。这些结果表明，RBSV是植物呼肠弧病毒亚组Ⅰ的一个新成员。     

茄子花叶病病原病毒鉴定

茄子花叶病是近年来山东分布较广的一种病害。发病植株表现斑驳、花叶、严重株叶片卷曲、矮化和畸形。从发病植株上分离到一病毒分离物(Smv—1)。可以通过汁液摩擦接种传播和由蚜虫非持久性传播。人工摩擦接种可侵染8科中的21种植物。系统侵染普通烟、心叶烟、黄瓜和番茄。局部侵染苋色藜、昆诺阿藜。此病毒的钝化温度为55～60℃10分钟,稀释限点为10~(-(?)～10~(-4)。体外存活期为5天(22C)。用差速离心法可以提纯该病毒,部分提纯的病毒最大紫外吸收峰为259nm,最小吸收峰为239nm,表现为典型的核蛋白吸收。A260/A280=1.68。SDS—不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳解离病毒得到外壳蛋白亚基为一条多肽链,分子量约为25000道尔顿。琼脂免疫双扩散试验表明,Smv—1与黄瓜花叶病毒抗血清有阳性反应。用1.5%醋酸双氧铀负染。电镜观察部分提纯病毒粒子为球形(正二十面体)、直径为28～30nm。根据上述特征,Smv—1是黄瓜花叶病毒的一个株系。     

温州蜜柑萎缩病毒的提纯法研究

本文提出的温州蜜柑萎缩病毒(SDV)提纯法,仅用100～200克病洋酸浆叶,且无需通过蔗糖密度梯度离心,在电镜下亦能看到中量直径约25nm 的球状病毒颗粒,粗提纯制剂OD_(860)/OD_(280)平均值为1.28,OD_(260)/OD_(240)平均值为1.15,初步显示出SDV 特征性紫外吸收曲线,提纯病毒产量约为4.5～11mg/kg病叶。比较证明,0.01M、PH7.0和0.1M、PH6.6的柠檬酸缓冲液以及0.5M、PH7.0的磷酸缓冲液是适宜的抽提缓冲液,洋酸浆是最好的繁殖寄主。     

番木瓜环斑病毒的提纯研究

详细报道了影响番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）粗提纯效果的几个主要因素（繁殖寄主种类，有机澄清剂，分散剂，病毒浓缩前的去渣离心力，浓缩病毒的超离心力等）的最佳选择，繁殖寄主以角葫瓜最好。该研究综合上述最佳选择而拟定的一次差速离心和一次３０％蔗糖硫酸连续密度梯度离心３ｈ的简单程序较好地提供了ＰＲＶ提纯的病毒有典型核蛋白紫外吸收曲线，Ａ２６０／Ａ２８０＝１．６８，提纯产量为２．５６ｍｇ／１００ｇ西葫芦病叶，所     

昆明香石竹斑驳病毒鉴定

 从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物,经电镜负染观察,该病毒为直径是28～33 nm的球状粒子,病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线,OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.70;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。由此,可基本认为该病毒分离物为香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus, CarMV)。     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒提纯和抗血清制备

采用PEG沉淀并结合差速离心技术,获得了精提纯的侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV-Li).提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线.OD260 nm/OD280 nm=1.236.将提纯病毒免疫兔子制备得CMV-Li抗血清.经微量沉淀法和间接ELISA法测定,其效价分别为1∶1024、1∶4096.两种方法相比,间接ELISA具有灵敏度高、特异反应强等优点.     

甘蔗花叶病毒的提纯及抗血清制备

以ＳｃＭＶ－Ａ为材料,采用ＰＥＧ沉淀结合差速离心技术,经１０－４０％蔗糖密度梯度离心后再经浓缩后即为提纯病毒制剂。该提纯病毒具有典型的核蛋白吸收曲线,最大紫外吸收值在２５７ｎｍ处,最小紫外吸收值为２４０ｎｍ,Ａ２６０／２８０＝１．６８,病毒产量可达１．２５－１．３７ｍｇ／ｋｇ。将提纯病毒免疫家兔制备抗血清,所制备的抗血清经Ａ蛋白酶联免疫吸附法测定,其效价为１／１０２４,且可用于检测甘蔗花叶病毒。     

玉米矮花叶病毒山东和北京两分离物的比较鉴定

引起北京和山东玉米矮花叶病的北京分离物(MDM-BJ)和山东分离物(MDM-SD)主要侵染禾本科植物，二者的寄主范围和症状反应又有一定的差异。提纯MDM-BJ的最大吸收峰在260nm，最小吸收峰在240nm，OD260／CD280=1．18。提纯病毒产量为1．5mg／100g鲜病叶。病毒粒体弯曲线状，平均长度为710nm。在感病组织内可以观察到风轮状、卷旋状和片层凝集状内含体。MDM-BJ和MDM--SD都能与玉米矮花叶病毒(MDMV)的抗血清反应。上述结果表明，北京和山东的两个分离物都是玉米矮花叶病毒(MD-MV)。引起我国玉米矮花叶病的毒原是不同于国外毒原的新株系。     

芫荽花叶病病原病毒鉴定

 从芫荽(Coriandrum Sativum L.)花叶病株上分离到一病毒分离物(CMV-Co),汁液摩擦接种和桃蚜(Myzus Persicea)均能传毒。人工摩擦接种可侵染5科21种植物,在黄瓜、心叶烟等植物上引起系统花叶;在苋色藜、昆诺阿藜、豇豆等接种叶片上引起局部枯斑。此病毒的钝化温度为55～60℃,稀释限点为10^-3～10^-4,体外存活期2～3天。部分提纯的病毒最大紫外吸收为258nm,最小吸收为238nm,表现为典型的核蛋白吸收,A260/A280=1.26.SDS-不连续梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳解离病毒其外壳蛋白亚基为一条多肽链,分子量约为25500道尔顿。琼脂免疫双扩散试验表明,CMV-Co与黄瓜花叶病毒有明显的血清学反应:用1.5%醋酸双氧铀负染,电镜观察病毒粒子球形(正二十面体),直径为28～30nm.根据上述特征,CMV-Co是黄瓜花叶病毒的一个株系。     

引起二月兰花叶病的芜菁花叶病毒研究

在表现花叶、植株矮化、茎叶坏死和畸形的十字花科观赏植物二月兰（Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓｖｉｏ－ｌａｃｅｕｓ）上分离到一种线状病毒,其病毒粒子分布范围为７８０～８００ｎｍ．通过寄主反应测定、病毒提纯和形态观察、血清学反应测定,确定该病毒为芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）．病毒分离物ＡＨ１回接二月兰无病毒苗,引起黄斑、系统花叶、系统坏死和畸形,在供试十字花科植物上均产生系统侵染,并在洋酸桨等茄科供试寄主上引起系统症状．ＡＨ１与来自十字花科甘蓝型油菜上的一个ＴｕＭＶ有紧密的血清学关系,但在寄主反应上与之有一定差异．对自然发病的二月兰植株和接种ＡＨ１分离物的系统寄主用ＴｕＭＶ抗血清进行免疫电镜观察,均检测到线状病毒粒子,用ＣＭＶ抗血清、ＴＭＶ抗血清进行检测,均没有发现相关病毒．作者认为：ＴｕＭＶ即是引起二月兰花叶病的病原．这是ＴｕＭＶ侵染该属植物的首次报道．     

大蒜病毒病原的鉴定及组培脱毒研究

系统鉴定的结果表明,为害大蒜的病毒有GLV,GMV和TMV。GMV引起大蒜花叶及条纹花叶,而GLV在大蒜上表现潜隐症状。GLV的紫外吸收峰最低在245.2nm,最高在275.7nm,其A260/280为1.36。GLV和GMV粒子大小分别为548～700×13nm和750～773×13nm。德国GLV抗血清仅与GLV有阳性反应。采用0.10～0.25mm生长点能完全脱除病毒,而用0.30～0.70mm有部分脱毒效果。     

外壳蛋白基因片段介导的高抗TuMV研究

为了获得对芜菁花叶病毒（TuMV）高度稳定的抗性,选取TuMV的外壳蛋白（CP）基因近3′端保守区共377 bp的核苷酸序列,构建了抗TuMV的发卡结构RNAi载体,并转化了TuMV的天然宿主拟南芥。转基因植株用北京地区TuMV主要流行的强致病株系BJ-C4人工接种。鉴定的8个转基因株系中有3个株系表现出对TuMV的高度抗性。定量PCR结果显示,高抗转基因株系体内几乎检测不到病毒的积累。     

湖北省蔬菜病毒病主要毒原种类检测

采用斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)和RT-PCR法对采自湖北省7个地区的966份疑似感染病毒的蔬菜样本进行黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)共7种病毒的检测。结果显示检出阳性样本695份,占总样本数的71.9%。其中,十字花科蔬菜上主要毒原为TuMV,检出率高达86.4%,其次为CMV,检出率为26.7%;茄科、葫芦科和豆科蔬菜上主要毒原均为CMV,检出率分别为34.3%、59.2%和56.2%。CMV几乎能侵染所有蔬菜,为湖北省蔬菜病毒病的主要毒原。在检出的6种病毒中,存在TuMV+CMV、TuMV+BBWV、TuMV+CMV+BBWV、CMV+BBWV、CMV+ToMV和CMV+BBWV+TSWV+TMV等6种复合侵染类型,其中TuMV+CMV为十字花科蔬菜上的主要复合侵染类型,复合侵染率为23.8%,其他蔬菜上主要侵染类型为CMV+BBWV,复合侵染率为28.0%。     

武隆烟区烟草病毒病的病原初步鉴定

对重庆市武隆烟区田间烟草进行了病毒病病原种类的调查和鉴定。26个烟草样品经ELISA共检测到TMV,CMV,PVY及TuMV等4种病毒。所有样品均感染TMV,且病毒复合侵染严重,其中,以TMV,TuMV,CMV及PVY等4种病毒的复合侵染为主,侵染率达30．77％。ELISA结果表明,复合侵染的样品中TMV含量最高,TuMV含量最低。