套式 PCR方法在泰泽氏菌检测中的应用和验证

用泰泽氏菌 RJ株感染的大鼠肝组织匀浆腹腔注射 Scid小鼠和 BALB/c小鼠,提取注射后小鼠肝、肾、肺、脾的 DNA, PCR扩增,核酸杂交.根据泰泽氏菌的保守序列合成引物扩增泰泽氏菌的基因组 DNA,建立了泰泽氏菌的套式 PCR方法,并将此方法应用于 Scid小鼠和 BALB/c小鼠以及可疑样品的检测,其中 Scid小鼠的肝、肾组织和 BALB/c小鼠的肝组织及可疑组织得到特异性扩增带,其他动物样品和组织 DNA均为阴性结果.进一步对该 DNA片段进行核酸杂交,结果证实,凡 PCR套式扩增为阳性的,均有杂交带.因此,泰泽氏菌套式 PCR方法在实际检测中是切实可行,其具有敏感性和特异性高的优点.     

狐阴道加德纳氏菌PCR诊断方法的建立与应用

【目的】建立快速检测狐阴道加德纳氏菌的PCR诊断方法。【方法】根据阴道加德纳氏菌16S rRNA基因序列设计1对特异性引物,以分离的狐阴道加德纳氏菌菌体DNA为模板进行PCR扩增,建立狐阴道加德纳氏菌的PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性及其可行性进行检验。【结果】特异性试验结果表明,狐阴道加德纳氏菌能扩增出437 bp的特异性核酸片段,而大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为500 mL-1。利用建立的PCR检测方法,对9株从山东省不同地区分离的疑似狐阴道加德纳氏菌菌株进行检测,结果有4株为阳性。【结论】研究建立的狐阴道加德纳氏菌PCR快速诊断方法,敏感性高、特异性强,可1次检测多个样品。     

牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法的建立

    为建立从奶品中监控布氏杆茵感染的方法,根据牛布氏杆菌omp25、omp31和16S rRNA基因序列设计内、外向引物,优化牛奶样品中布氏杆菌基因组DNA提取方法,建立牛奶样品布氏杆菌套式PCR方法结果显示,使用人工合成的两对F4/R2和F2D/R1U套式引物,通过两次扩增,可有效扩增出牛奶中污染布氏杆菌的16S rRNA的特异性DNA片段,其对牛奶样品中布氏杆菌检测下限达33CFUmL-1.该套式PCR与大肠杆菌、溶血性链球菌、沙门氏茵、克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和螺旋杆菌等相关细菌DNA无交叉反应,显示高度的布氏杆菌特异性,其与布氏杆菌分离鉴定的符合率达100%本试验建立的布氏杆菌套式PCR检测方法具有较好的特异性和敏感性,适用于牛奶样品中布氏杆菌的实验室快速检测     

基于HSP60基因哈氏弧菌PCR检测方法的建立

研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法.结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA.表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断.     

牛源环孢子虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

 【目的】 建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。【方法】根据牛源环孢子虫18S rDNA序列，设计1对保守引物和1对特异性引物，建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法。通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件，进行特异性和敏感性试验。并对168份临床样品进行了检测。【结果】该套式PCR能特异性地扩增出牛源环孢子虫基因组DNA中相应片段，与艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应；最低能检测到2.85×10-2 fg的阳性参照DNA；对临床样品检测结果表明PCR技术检查阳性者显微镜检查都为阳性。【结论】建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性，有较好的临床应用价值。     

BALB/C小鼠不同组织RNA提取方法的比较

为获得高质量BALB/C小鼠的核酸用于荧光定量RT-PCR分析,用某公司的RNA试剂盒、TRIzol试剂、氯化锂分别提取BALB/C小鼠心脏、肝脏和肾脏组织中的RNA。经紫外分光光度计检测发现,用TRIzol试剂在小鼠肾脏组织中获得的核酸片段具有更高的纯度及浓度,而1%琼脂糖凝胶电泳检测发现三种来源的RNA均具有较好的完整性。RT-PCR方法扩增小鼠主要组织相容性复合体蛋白H-2K编码基因,3个样品均可扩增出104 bp的特异性条带。试验验证了TRIzol试剂从不同组织中提取小鼠总RNA均可作为RT-PCR的模板,为后续试验工作奠定基础。     

二温式PCR检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌方法的建立与应用

为了探索简便、快速确诊猪传染性胸膜肺炎的方法,根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apx IV基因序列,设计合成1对特异性引物,建立聚合酶链反应(PCR)检测APP的方法。采用该方法对APP和其他6种猪病病原核酸进行检测,结果只对APP扩增出与预期大小相符的422bp DNA片段,而对其他6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该PCR最低可检出10pg的APP DNA。对送检的46份可疑病猪组织进行检测,结果有19份样品为阳性,27份为其他病原感染。     

PCR检测鸭疫里默氏菌的研究

对本研究室分离、鉴定并保存的42株鸭疫里默氏菌(包括8个血清型)、9株鸭源大肠杆菌和4株鸭源禽多杀性巴氏杆菌进行PCR扩增，结果所有的鸭疫里默氏菌均能扩增出809bp的特异性DNA片段，而鸭源大肠杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌均为阴性。试验证明以细菌DNA和全菌体分别作模板，对PCR的扩增结果无影响。经过优化的该PCR方法能检测出的最低DNA量为1pg。     

贝类派琴虫半套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中派琴虫(Perkinsus sp.)的基因组序列,设计了3条特异性引物Perkinsus303-1、Perkinsus303-2和Perkinsus209-1,建立了检测贝类派琴虫的半套式PCR方法。该方法对派琴虫检测得到209 bp的特异性扩增带,检测灵敏度达到0.01 fg的派琴虫质粒DNA。用该半套式PCR对临床样品进行检测,结果表明广西牡蛎、连云港的菲律宾蛤仔和温州溢蛏存在派琴虫感染,说明建立的半套式PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。     

多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中LM的快速检测。     

禽淋巴细胞性白血病的病理学观察与RT-PCR鉴定

采用组织病理学观察和RT-PCR检测对贵州省某鸡场一批230日龄疑似禽淋巴细胞性白血病的蛋种鸡群进行诊断。结果表明,该批发病蛋鸡群的眼观病变明显,肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊和盲肠扁桃体肿大2～3倍;组织学检查显示肝、肾、法氏囊等组织中有大量大小一致的成淋巴细胞散在或呈团块状增生,挤压并破坏正常组织;选取针对禽白血病病毒群特异性抗原p27基因设计引物,经RT—PCR检测,可从发病蛋鸡肝和脾组织病料中扩增出与预期大小相一致（分子长404bp）的DNA片段,其中肝的特异性病原核酸的检出率达到90％,脾的特异性病原核酸的检出率达到50％。以上结果证实,该蛋鸡场存在禽淋巴细胞性白血病的感染,且通过PCR检测可得知肝脏的病原核酸检出率明显高于脾脏。     

斑点叉尾鮰肠败血症PCR诊断方法的建立

为了建立快速、敏感的聚合酶链式反应(PCR)诊断斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus的肠败血症技术,作者根据NCBI公布的鮰爱德华氏细菌序列,设计了一对特异性诊断引物CM3/CM4,对鮰爱德华氏细菌特异基因片段进行PCR扩增试验,PCR反应条件的优化以及不同检测材料的比较,同时测试了该方法的特异性和敏感性,并对广西4个市县临床样品进行了检测.结果表明:用该引物可以扩增到与预计大小相符的276 bp鮰爱德华氏菌特异性片段;PCR反应与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、迟缓爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;用该PCR法可以检测出病鱼脑、肝、肾及脾中的病原菌,检测的最低细菌数为12个,且病鱼内脏组织、菌落及菌液均可直接用于该PCR扩增;临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析和生化鉴定结果一致.因此,本试验中所建立的PCR检测方法在斑点叉尾鮰肠败血症的诊断和防治方面具有较好的应用前景.     

猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法的建立

建立了病猪肺脏组织的处理方法和DNA提取方法,根据猪肺炎支原体的P36基因设计一对引物,建立猪肺炎支原体PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验,使用建立的方法检测了临床样品。结果表明,建立的检测方法能成功从猪支原体肺炎可疑肺组织中扩增出目的条带,成功建立了猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法,为该病的诊断提供了条件。     

反向PCR克隆转基因水稻的外源基因旁侧序列

以反向PCR（IPCR）为基础建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序称的技术体系，该方法中用小量法提取转基因水稻总DNA；总DNA用10倍过量的限制性内切酶在50μL反应体积中进行过夜酶切；酶切片段在20μL体积中进行自连接，之后进行套式PCR（nested-PCR)扩增旁侧序列。在套式PCR结合了热启动PCR和降落了PCR技术以增强PCR反应的特异性。用这种方法，本实验室在一周内克隆了35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在300－750bp之，PCR产物的特异性用Southern杂交进行了证明，实验结果表明这个方法具有快速、稳定和高效的优点。     

养殖乌鳢内脏结节病的病原分离、鉴定与药物敏感性分析

从患内脏结节病的四川眉山地区养殖乌鳢腹水和肝、脾、肾组织中分离并纯化培养、筛选出1株致病菌,经形态结构、染色观察、生理生化实验、16SrRNA基因和特异性序列的PCR检测进行菌株的鉴定,并进行分离菌株的药物敏感性实验。结果发现,该分离株具有与诺卡氏菌Nocardia较一致的形态特征和相似的生化特性。16SrRNA基因的PCR扩增、测序和系统发育分析显示,该菌株与诺卡氏菌属的亲缘关系较近,同源性较高,与诺卡氏菌Nocardia seriolae的16SrRNA基因序列相似性高达99%以上;诺卡氏菌的特异性引物N5F1/N5R1的PCR检测结果表明该菌为诺卡氏菌;药物敏感性结果显示,该菌对四环素、强力霉素、美满霉素、阿奇霉素、磺胺异噁唑和利福平等药物敏感。     

DNA芯片技术研究进展

DNA芯片技术是近年来发展迅猛的生物高新技术，它是利用光刻合成、高速打印或电定位等技术，在支持物硅、玻璃或尼龙膜上胺照特定的排列方式有序地固化大量的基因探针，形成DNA微阵列。生物样品DNA／RNA通过PCR／RT－PCR扩增和荧光标记后与DNA微阵列杂交，通过荧光扫描器及计算机分析，即可获得样品的基因序列及表达的信息。     

PCR技术在住肉孢子虫虫种鉴定上的应用

采用 RAPD 方法对水牛梭形住内孢子虫、待定种及黄牛枯氏住内孢子虫缓殖子基因组 DNA 进行了分析,待定种 PCR 产物的电泳带型与枯氏住肉孢子虫的差异较梭形住内孢子虫大,这与二者表型性状一致的研究结果不吻合.对3种包囊种特异性的 PCR 指纹进行了筛选,回收和纯化了3种包囊种特异性的 DNA 片段,待定种0.7kb 片段经α-~(32)PdATP 标记后用作探针,只与同源 DNA 杂交,不与其它包囊、宿主细胞和艾美耳球虫杂交,用 pGEM-T Easy Vector 对该片段克隆成功,并测出其全长序列,为进一步设计特异引物建立标准 PCR 诊断方法和用作核酸探针奠定了基础。     

布鲁菌PCR检测方法的建立及其应用

本文根据已发表布鲁菌BCSP31基因序列,设计1对引物,以布鲁菌19号苗基因组DNA作为模板,建立诊断牛布鲁菌病的PCR方法,并对方法的特异性、敏感性及适用性进行验证.结果显示,PCR能扩增布鲁菌BCSP31基因特定序列.该方法对布鲁菌的最小检出量为9pg,对葡萄球菌26001株、大肠杆菌O78等7种参照菌株的核酸扩增结果均为阴性.建立的PCR方法具有快速简便、特异性强、敏感性高等特点.     

向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法的研究

[目的]建立向日葵白锈病菌(Albugo tragopogi(Persoon)Schruter var helianthi Novotlenova)的巢式PCR检测方法.[方法]用通用引物NL1/NL4对采自伊犁的向日葵白锈病菌进行PCR扩增、克隆、酶切和测序,设计该病菌的特异性引物,用巢式PCR法检测供试样品.[结果]序列测定和比对结果表明,该病菌的核酸序列与GeneBank公布的向日葵白锈病菌核酸序列同源率为97;.针对该段基因设计向日葵白锈病菌的特异性引物ATHP3/ATHP4,用巢式PCR法对供试样品进行扩增,扩增片段为370bp.[结论]成功建立了向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法.     

DDK品系小鼠遗传特异性的RAPD分析

应用随机扩增多态DNA技术(RAPD)对DDK,C57BL/6,BALB/c,KM,PWK 5个品系的小鼠进行了遗传分析.选用130个随机引物对其基因组DNA进行PCR扩增.根据电泳结果,其中31个引物扩增出明显的多态性条带,共检测到345条扩增片段,其中多态性片段277条,占80.3%,反映了5个品系间的遗传变异.多态性统计分析表明,C57BL/6与BALB/c之间的遗传距离指教为0.013 29,遗传关系最近;DDK与KM,C57BL/6遗传距离指数相似分别为0.014 73,0.0147 6,遗传关系较近,与PWK遗传距离指数为0.016 86,遗传关系最远.结果显示DDK品系小鼠与其他实验室品系之间有遗传的相似性,也存在差异.同时也证明了RAPD技术可以作为分子标记,很好地检测实验室近交系小鼠间的亲缘关系及其遗传特异性.