荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测.结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应,最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应.荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间,该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验.     

猪瘟兔体免疫交互实验中的Ⅰ型变态反应

兔体免疫交互实验是一种较为特异性的猪瘟诊断方法,也就是实验兔在猪瘟野毒(对兔无毒力,但具有抗原性)的刺激下,产生特异性抗体,从而中和注入兔体内的猪瘟兔化毒对兔的毒力,然后以兔体是否出现体温反应作出判定.若实验兔出现定型热反应(猪瘟兔化苗毒力未被中和)判定为猪瘟阴性,不出现体温反应(兔化苗毒力被中和)则判定为阳性。然而这里明显地忽略了家兔在该实验中可能出现的Ⅰ型(速发型)变态反应。我们知道,不管是病毒中和反应,还是Ⅰ型变态反应,都是抗原-抗体特异性结合的反应,只不过是参与反应的抗体种类不同而已.对前者,我们认为主要是由免疫球蛋白 IgM、IgG 参与的抗原-抗体反应,后者则主要是由 IgE(近代还证明家兔乙     

ELISA法检测猪瘟抗体消长规律的试验研究

本试验采用间接ELISA方法,检测猪瘟(CSF)常规免疫仔猪的CSF抗体水平。试验分A、B两组,A组首免注射4头份猪瘟兔化弱毒疫苗,B组首免注射2头份猪瘟兔化弱毒疫苗;二免两组均注射2头份猪瘟兔化弱毒疫苗。试验结果表明,注射疫苗后10d,开始产生抗体,20d-30d抗体达到峰值,二免后抗体峰值维持40d以上。首免4头份的仔猪比首免2头份的仔猪CSF抗体峰值出现的早,维持时间长。     

猪瘟兔化弱毒的研究 Ⅲ.猪瘟兔化弱毒对猪的免疫性

猪瘟兔化弱毒(以下简称兔化毒)在兔体已传至430代,注射家兔90%以上发生热反应。注射猪反应轻微,对妊娠母猪及仔猪的生长发育皆无不良影响,其详细结果已分别发表于前两篇报告。现将有关兔化毒对猪的免疫性试验结果,整理报告如下:     

蟾酥注射液对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果影响的试验观察

为观察蟾酥注射液对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果的调节作用,选择高、中、低剂量(0.2mL/kg、0.1mL/kg、0.05mL/kg)的蟾酥注射液与猪瘟兔化弱毒疫苗联合使用作试验组,猪瘟兔化弱毒疫苗组、猪瘟兔化弱毒疫苗与盐酸左旋咪唑+黄芪多糖组、空白组作为对照。试验猪在用药前及首次用药后的7d、14d、21d、28d,通过静脉采集血液,用试剂盒检测血清中猪瘟免疫抗体效价和IL-2水平。结果显示,蟾酥注射液高、中剂量组能够显著提高接种猪瘟兔化弱毒疫苗猪的血清中抗体水平(p0.05);不同剂量蟾酥注射液对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫猪血清IL-2的产生具有不同程度的促进作用,其中蟾酥注射液高剂量组作用快,持续时间较长。本试验的结果说明蟾酥注射液是猪瘟兔化弱毒疫苗有效的免疫佐剂。综合考虑,推荐蟾酥注射液的临床应用剂量为肌内注射0.1mL/kg体重,1日2次,连用3日。     

家兔兔瘟HI抗体水平对猪瘟活疫苗效力检验结果的影响

按照《兽用生物制品规程》方法,应用具有不同兔瘟HI抗体水平的家兔进行猪瘟活疫苗的效力检验。实验结果表明,家兔的兔瘟HI抗体水平对其接种猪瘟活疫苗后诱发的体温反应无干扰作用。     

猪瘟兔化弱毒的研究——Ⅰ 猪瘟兔化弱毒对家兔的感染性

(一)用四株猪瘟病毒感染家兔,从中选育出一株能适应于家兔同时减弱了对猪的致病力。这株猪瘟兔化毒自1954年初至1958年底已通过大耳白兔430代。家兔感染兔化毒仅发生体温反应,无其他临床症状及特征性病理变化。 (二)病毒在通过大耳白兔的过程中,家兔出现的热反应率,随通过兔体代数的增多而增高。1955年通过兔体120代,平均热反应率80％,定型热占63.75％,自80代往后,热反应率开始上升;1956年通过兔体100代,平均热反应率达92.96％,定型热占78.33％;1957年全年平均热反应率一直维持在90％以上,到1958年,平均热反应上升到97.97％,定型热反应占87.87％。显然较早期毒的热反应率为高。 (三)经由静脉接种,反应兔的定型热潜伏期平均为33小时。热稽留期平均为22小时左右,温差达1℃以上。轻热反应潜伏期平均为39小时左右,熱稽留期平均为18小时左右。病毒传代时,按连续每6—8小时测体温一次,就可掌握体温曲线。一般在接种病毒后,体温降达常温前后剖杀采毒。 (四)不同产地家兔接种病毒后,热反应率稍有不同,敏感的大耳白兔和长毛种兔,出现热反应率较高。 (五)兔毒经皮下、肌肉、口腔、鼻腔、静脉接种,都可使兔发生感染。不过经皮下、肌肉和口腔感染发生热反应率稍低;口腔及鼻腔接种的潜伏期,要延长到47—100小时。健康兔与感染兔同笼饲养14—15天,未发生接触感染。 (六)热反应兔的各种脏器中均有病毒。用兔滴定的毒价是:脾达10~(-5),淋巴结达10~(-4)—10~(-5),肺、胸腺达10~(-3),心肌达10~(-2),血达10~(-2),肝、肾10~(-1)—10~(-2),脑10~(-1)。无热反应兔的脏器中,也有与热反应兔相等的病毒,测定脾脏毒价也达10~(-4)—10~(-5),对猪免疫性同样好,证明兔毒确已100％感染家兔。 (七)用大耳白兔测知兔毒在反应兔体内存活期,在接种兔毒后第3—6天内,毒价维持在高峰,第7天开始降低,到第12天在兔体内已测不到病毒。 (八)感染兔在发热期內,白血球总数无变化,但出现淋巴球减少和中性白血球增多,消长时间与体温升降基本吻合,在体温恢复正常后,白血球分类比数也恢复正常。     

冢兔兔瘟HI抗体水平对猪瘟括疫苗效力检验结果的影响

按照《兽用生物制品规程》方法，应用具有不同兔瘟HI抗体水平的家兔进行猪瘟活疫苗的效力检验：实验结果表明，家兔的兔瘟HI抗体水平对其接种猪瘟活疫苗后诱发的体温反应无干扰作用。     

齐卡肉兔接种猪瘟兔化弱毒(C株)的热型观察

为了查找生产中原料兔接种猪瘟兔化弱毒C株病毒后定型热比例常低于70%的原因,观察了无猪瘟病毒抗体的8个批次,共3 512只中型齐卡肉兔对猪瘟兔化弱毒C株病毒的热型反应。结果:定型热占(91.3±1.5)%,轻热(5.8±1.2)%,可疑(1.8±1.5)%,无反应(0.9±0.7)%;8个批次的试验兔,对5个毒种代次的体温反应,差异不显著(P0.05)。研究认为,来自农村养兔户的原料兔,可能接触过猪瘟病毒,致定型热比例下降;无猪瘟抗体的中型齐卡肉兔,对不同代次的猪瘟兔化弱毒C株病毒均有良好的体温反应,可作为猪瘟弱毒疫苗(脾淋源)的原料兔。     

猪瘟兔化弱毒的研究——Ⅲ 猪瘟兔化弱毒对猪的免疫原性

猪瘟兔化弱毒(以下简称兔化毒)在兔体已传至430代,注射家兔90％以上发生热反应。注射猪反应轻微,对妊娠母猪及仔猪的生长发育皆无不良影响,其详细结果已分别发表于前两篇报告(Ⅰ、Ⅱ)。现将兔化毒对猪的免疫原性试验结果,整理报告如下: 试验经过和结果一、兔化毒对猪最小免疫量的测定及其对兔最小感染量的关系 (一)兔化毒对猪最小免疫量的测定:在种毒继代试验过程中,曾分别采取不同代     

猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法研究进展

猪瘟兔化弱毒(HCLV)虽可在多种细胞上生长,但不产生细胞病变,这使得猪瘟疫苗的效价评价工作变得较为困难。目前,家兔热反应是HCLV病毒效价测定和CSF疫苗成品效力检验的主要方法。然而,HCLV所致的兔热反应存在个体差异大和测定时间长等问题,迫使人们寻求新的更为快速、敏感和精确的效力检验替代方法。笔者就近年来猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法的研究进展做一综述。     

猪瘟兔化弱毒疫苗制造过程中几个问题的探讨

过去我县猪瘟流行极广,死亡严重,自1956年以来由于大力开展预防注射工作,经过八年的坚持,猪瘟已基本消灭。在八年的制苗实际操作过程中,发现了几个共同性的问题,探讨如下:一、兔毒经过保存与兔产生热反应关系现阶段种毒对家兔感染力,主要表现在体温反应上,接种后的家兔产生体温反应,则表示猪瘟病毒在兔体内繁殖。在不同的温度下保存种毒,接种兔后,共形成的热反应曲线,有明显差异。例如1959年6月8日,用保存在22℃的冰瓶内三天后的脾种毒,接种了7只兔,其中在48小时     

猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立敏感、特异的评价猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗中病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法,参照中国猪瘟石门株兔化弱毒全长序列,在猪瘟兔化弱毒活疫苗基因组5'非编码区设计1对标准品引物、1对特异性引物和1条探针,建立检测猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法.该方法检测的敏感度达1.20×10⁵拷贝/mL;对猪繁殖与呼吸综合征、猪乙型脑炎、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病4种活疫苗基因组扩增结果均为阴性;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.29%～0.39%,批间变异系数为0.32%～0.61%.应用此方法对6个不同厂家生产的7种猪瘟兔化弱毒活疫苗中病毒含量进行了检测,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量存在较大差异.结果表明,建立的猪瘟兔化弱毒疫苗实时荧光定量RT-PCR方法能特异地检测疫苗病毒含量,可用于初步评价猪瘟兔化弱毒疫苗抗原含量.     

利用单克隆抗体检测猪瘟疫苗抗体的酶联免疫吸附试验

应用抗猪瘟兔化弱毒单克隆抗体通过亲和层析法纯化省瘟疫化弱毒抗原建立的酶联免疫吸附试验(简称 HCLY-MAb-ELISA)检测了12份来吃初乳仔猪的血清、235份猪瘟兔化弱毒疫苗安检用的猪的血清和226份免疫前后不同时期的猪血清抗,并以常规兔体血清中和试验(兔体 SN)进行了相关性分析.结果表明,该法敏感性高,特异性强,与兔体 SN 呈显著正相关(r=0.8032、P<0.05).本法可准确反应免疫猪群的抗体也答水平,且快速简便,易于推广。     

猪瘟大兔脾淋活疫苗——诸稳康

诸稳康系福州大北农生物技术有限公司用猪瘟兔化弱毒C株接种于健康成年家兔，收获感染出现了定型热的家兔的脾脏和肠系膜淋巴结制成乳剂，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成的猪瘟疫苗．又称猪瘟兔化弱毒脾淋组织疫苗。     

用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究

为用体外试验方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力,以猪瘟病毒抗体（兔源）为一抗、荧光素标记羊抗兔IgG 为二抗,建立了CSFV兔化弱毒株的间接免疫荧光检测方法（ IFA）。特异性试验表明,用该IFA方法检测CSFV兔化弱毒株接种的RK细胞为阳性,而检测伪狂犬病毒、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病毒接种的RK细胞均为阴性。 CSFV兔化弱毒株和活疫苗的兔体感染量（ RID）用兔体测定,半数组织感染量（ TCID50）用IFA测定,拟合RID与TCID50的线性回归方程,确定1RID/mL＝（ TCID50/0．1mL＋200）/12。     

ELISA间接法用于猪瘟免疫监测研究

本文介绍以猪瘟兔化弱毒犊睾细胞苗为材料提取猪瘟病毒抗原,以羊抗猪IgG—HRP结合物为免疫试剂,建立快速ELISA检测猪瘟抗体的方法,同时用血清中和试验进行比较,和ELISA抑制试验,证明该法特异,敏感,快速,准确,是进行猪瘟抗体监测的好方法。     

猪瘟兔化弱毒毒种保存期试验

本试验对３个代次不同冻干日期的猪瘟兔化弱毒进行了兔体最小感染量测定,并对经猪瘟兔化弱毒Ｆ４７６代毒繁殖冻干的两批猪瘟兔化弱毒Ｆ４７９代毒进行了免疫原性鉴定。结果表明,猪瘟兔化弱毒在－７０℃条件下保存１４年、１５年、２９年,其兔体最小感染量均无明显改变;繁殖的两批猪瘟兔化弱毒的最小免疫量均为１０＾－５稀释１ｍｌ,符合《兽用生物制品规程》规定。     

高效制备霍乱弧菌菌影及其增强猪瘟疫苗免疫效果的研究

为评价霍乱弧菌菌影(VCG)对猪瘟活疫苗及猪瘟病毒E2蛋白抗原区(BC和AD区)亚单位疫苗免疫增强效果的作用,本实验首先利用含有裂解质粒的霍乱弧菌制备VCG,通过对细菌裂解前后进行平板计数及透射电镜检测VCG裂解效果,结果显示所制备的VCG裂解率高,且基本形成一个完整的细菌空壳。在确定最佳猪瘟活疫苗使用量后探究VCG对猪瘟活疫苗(CFS ST)免疫效果的影响,实验分别用VCG+CFS ST和CFS ST免疫家兔一次,设置对照组,并在免疫第42 d后攻毒。本研究还探究了VCG作为佐剂对猪瘟E2蛋白主要抗原区蛋白亚单位疫苗免疫效果的影响,实验分别用完全弗氏佐剂(CFA)和VCG联合E2蛋白主要抗原区蛋白,通过间隔两周的方式分4次免疫家兔,设置对照组,并在免疫第56 d后攻毒。通过阻断ELISA方法每周检测家兔血清的抗体阻断率,免疫后以500 RID_(50)的猪瘟病毒弱毒株通过耳缘静脉注射方式对家兔攻毒。结果显示,50 RID_(50)的猪瘟活疫苗组家兔血清抗体阻断率显著降低(p0.001);VCG+CFS ST组家兔猪瘟抗体阻断率在免疫14 d后大部分时间点显著高于CFS ST组(p0.05),并且攻毒后仅对照组出现定型热反应;CFA(E2)组和VCG(E2)组的家兔猪瘟抗体阻断率均显著达到较高水平(p0.001),并且攻毒后仅对照组出现定型热反应。以上结果表明VCG可作为免疫佐剂增强猪瘟活疫苗的免疫效果;VCG联合猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区亚单位疫苗在家兔中也具有较好的免疫效果。本研究为研发廉价高效的疫苗佐剂提供重要的实验依据。     

猪瘟兔化弱毒ⅢC_3克隆株的培育与研究——Ⅰ.应用终点稀释-荧光抗体技术克隆猪瘟兔化弱毒

应用终点稀释-荧光抗体技术获得了克隆化弱毒株(ⅢC_3株)。ⅢC_3克隆株在PK_(15)细胞上传至15代,用DIF试验测定各代次毒价,TCID_(50)可达到10~(5.0)以上。经生物学鉴定试验表明,该克隆株保留了猪瘟兔化弱毒淋脾毒感染家兔出现的特异性热反应和对猪的安全性及良好的免疫原性。对猪最小免疫量达到10~(-5)稀释1ml,与淋脾毒一致。DIF试验与猪体测毒,两者之间存在着密切的相关性。