地高辛标记的DNA探针制备及其应用于溶藻弧菌的检测

从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针.分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测,检测结果表明,胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应,表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强;而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA也出现了较强的阳性反应,与霍乱弧菌DNA则无反应,表明该外膜蛋白DNA探针的特异性较低.说明所构建的溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针斑点杂交检测方法具有特异性强、简便易行,可应用于溶藻弧菌的快速检测.     

何首乌RAPD分析的最佳PCR条件筛选

以广西、广东、湖南、贵州、四川、湖北、江苏、安徽、山东、河南等10省共31个地理种源为材料，对其PCR各种反应条件实验进行了研究。结果表明：PCR反应时，总反应液20μL中基因组DNA浓度为20ng，引物浓度为10μmol／L，dNTP浓度为200μmol／L，镁离子的浓度选择1．5mmol／L，退火温度为38℃下出现可辨认的鲜明的谱带。本研究为RAPD分析应用于何首乌遗传多样性研究和优良种源选择打下了良好的基础。     

生物素标记犬瘟热病毒DNA探针的制备与纯化

用以选择犬瘟热病毒ＲＮＡ的有关碱基顺序，设计ＤＮＡ探针，并在５＇末端偶关一个氨基连接分子：５×ＡＧＧＧＣＴＣＡ－ＧＧＴＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧ３＇，共２３个碱基和一个氨基连接分子。ＮＨ２－ＤＮＡ探针在ＤＮＡ合成仪上合成。合成产物同生物素酰氨基已酸盐Ｎ－羟琥珀酰亚胺酯反应，反应物经高效硅胶薄层板纯化，得到生物素标记犬温热病毒ＤＮＡ探针。     

用Digoxigenin标记重组质粒DNA探针特异性的改良

鸡马立克病病毒基因组DNA的BanHI-K_3片断克隆的重组质粒DNA及从质粒上切下的经电泳和电洗脱提纯的BamHI-K_2DNA片断,在用非放射性Digoxigenin([dig])标记后,分别用作检测马立克病病毒DNA的探针。对两种探针特异性的比较表明,BamHI-K_3克隆的全质粒DNA探针对其它质粒来源的NDA仍表现出很强的交叉反应性,而用经电泳电洗脱提纯的BamHI-K_3DNA片断制备的探针,则仅对含同源DNA片断的质粒提取物或菌苔裂解物产生明显呈色反应,但对不含同源DNA的其它质粒DNA提取物几乎完全不呈现交叉反应。     

鸡的寡核苷酸探针DNA指纹研究

用人工合成的寡聚核苷酸（GT）10为探针产生8胪家系鸡的HaeⅢ酶切微卫星DNA指纹图谱。遗传距离分析结果表明：计算所得到的遗传距离与鸡的实际遗传背景一致，说明在缺少DNA指纹分析的小卫星探针或基因组探针的情况下，用合成容易，价格较低的寡核苷酸作为探针是可行的。     

EAV探针产生鸡DNA指纹图谱研究

以禽内源性反转录病毒片段（ＥＡＶ）为探针，成功地得到了ＳＲ９２Ａ系与萧山鸡杂交一代群代的ＤＮＡ指纹图谱，采用的限制性内切酶为ＥｃｏＲ１。结果表明：该探针在这种杂交群体中能检测１７个清晰可辨的指纹条带，这些条带在试验鸡群中的频率从０．２９￣１．０不等，个体携带条带总数也存在着从１０￣１６Ｗ     

检测葡萄无核基因DNA探针的合成与应用

利用细菌质粒 M13克隆葡萄无核基因的 RAPD标记 UBC- 2 6 94 50 后 ,采用自动荧光 DNA序列分析仪对其测序。结果表明 ,UBC- 2 6 94 50 由 4 84对核苷酸及其特定序列构成。按照该序列 ,人工合成两个寡聚核苷酸5′ CCAGT TCACT CTCAA TAGGT CC3′和 5′ CCAGT TCGCC CGTAA ATG3′分别作引物 ,当用获得该标记及其序列的亲本和无核杂种后代作模板进行 PCR分析 ,凡是可以扩增出约 5 90 bp片段即为无核基因携带者和表达者。进一步用其原始无核祖先无核白和商业化无核品种及 C78- 47× B52 - 1 2 2 杂交组合后代做模板进行 PCR扩增 ,凡出现约 5 90 bp的特殊标记即为无核基因携带者和无核性状表达者。研究结果证明 ,18bp寡聚核苷酸 5′ CCAGTTCGCC CGTAA ATG3′具有检测葡萄无核基因的探针作用 ,定名为检测葡萄无核基因的探针 1号 (GSL P1)。     

何首乌叶原生质体制备与融合研究

[目的]研究何首乌叶片原生质体的制备和融合方法。[方法]用机械法制备何首乌叶片的原生质体,用PEG结合高Ca2+-高p H诱导融合法来诱导其原生质体,研究原生质体的融合现象。[结果]何首乌叶片在25℃和35%的蔗糖溶液中处理30 min能够制备出较多的完整原生质体。用20%PEG融合液处理原生质体20min能够有效地诱导何首乌原生质体的融合,2个细胞的融合效率为11.7%,表明用机械法制备的原生质体也是有活性的。[结论]该技术为何首乌原生质体培育奠定了基础。     

超声波-微波协同提取何首乌多糖的工艺研究

研究了超声波-微波协同提取何首乌[Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.]多糖的最佳工艺条件,以何首乌多糖提取率为综合指标,考察料液比、提取次数、超声时间、微波时间4个因素对提取效果的影响,在此基础上,利用中心组合试验设计对提取工艺进行优化,最佳工艺条件为料液比1∶21(g∶m L),超声时间15 min,微波时间3 min,提取1次,在此条件下多糖实际提取率可达19.74%。     

异羟基洋地黄毒甙元核酸探针对马立克氏病毒DNA的检测

应用异羟基泣地黄毒甙元标记的ＤＮＡ探针，检测了细胞培养物和鸡羽髓中提取的马立克氏病毒核酸。结果发现，异羟基洋地黄毒甙元标记的马立克氏病毒血清Ⅰ型（ＧＡ株）核酸的ＢａｍＨＩ－Ｌ片段探针，只与马立克氏病毒Ⅰ型核酸发生杂交，而不与Ⅱ型（ＳＢ－１）或Ⅲ型（ＨＶＴ）发生杂交。对３６份鸡羽髓病料提取的病毒核酸的杂交检测与琼扩试验相比较，前阳性率为９４．４％。后仅为８６．１％。由此说明，Ⅰ型病毒的核酸探针可     

DNA 条形码在山茶属近缘植物鉴别中的应用

山茶属(Camellia)是山茶科(Theaceae)中物种丰富、经济效益较高的属.分类学上对山茶属的亚属、组以及种的划分争议较大,著名的3大山茶属植物分类系统分别由Sealy、张宏达和闵天禄提出.DNA条形码技术是指通过对植物基因组中的特定基因进行片段扩增、测序发现其碱基变化规律的技术手段,在分类学研究中显示出巨大的应用潜力.选取trnH-psbA和matK序列的通用引物,对山茶属不同植物基因组DNA进行扩增和序列测定,分别得到了ttrnH-psbA序列和marK序列各61条,山茶属matK序列相似度极高(98.40％),物种分辨率较低.trnH-psbA的属间物种分辨能力达到100％,而在山茶属内物种分辨率仅为13.11％.结果表明:trnH-psbA序列能够有效地区分不同属间的植物,但种间分类能力较弱.     

禽流感H5和H9亚型基因探针的制备

参照GeneBank数据库上H5N1和H9N2 AIV的HA基因序列,选取保守区域,设计了两对引物,分别用于扩增HA基因,产物纯化回收得到180 bp和285 bp cDNA片段,采用随机引物法Digxigenin11-dUTP标记得到探针H5PR和H9PR,通过斑点杂交检测,结果表明探针的灵敏度高和特异性好,可以进行相关性试验.     

RT-PCR和核酸探针在IBV检测中的应用

用ＰＣＲ和核酸探针杂交检测了３种毒株（Ｈ１２０株,Ｍ４１株,ＨＫ株）在鸡胚中的繁殖动态及人工感染鸡和自然感鸡气管粘液及肾组织内的ＩＢＶ．结果表明：在鸡胚中繁殖３种毒株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）,ＰＣＲ最早检出时间为２０～２４ｈ,克隆探针最早检出时间为２４～３０ｈ;用克隆核酸探针检测人工感染鸡,１２ｈ后能从肾脏中检出病毒。对７只就诊鸡的病变肾脏进行杂交检测和ＰＣＲ扩增,有５只均呈阳性反应。ＩＢＶ分离株ＨＫ株与标准株Ｍ４１株经ＰＣＲ扩增、ＨａｅⅢ和ＨｉｎｄⅢ酶切及ＲＦＬＰ分析,表明其属同一马萨诸塞血清型。ＰＣＲ和核酸杂交技术为生产上提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测ＩＢＶ病毒及诊断ＩＢＶ的新方法,对ＩＢＶ的血清定型也有一定的实用价值。     

用作植物疫苗的转基因胡萝卜的分子生物学筛选与鉴定

以包含有不同外源病毒基因的转基因胡萝卜为试验材料,应用分子生物学手段,从DNA水平上和蛋白质水平上对这些材料加以鉴定,经PCR引物筛选后得到转基因胡萝卜的阳性率为38%左右;为保证实验的可靠性和可行性,防止检测过程中遗漏和错误的发生,用特异的PCR引物对检测结果进行复选,得到的植株阳性率为7%.在蛋白水平上应用ELISA检测法检测获得的阳性植株的结果与PCR检测结果相同,且同时发现外源基因在胡萝卜根中的表达量明显小于在叶中的表达量.     

肉鸡群中呼吸道病原体共感染情况调查

【目的】对肉鸡群中常见的呼吸道病原体共感染情况进行调查,为肉鸡呼吸道疾病的防控提供流行病学资料。【方法】从山东省济南、潍坊、青岛等地区采集421份有呼吸道症状的病(死)鸡肺脏及160份临床健康肉鸡的肺脏作为供检样品,用特异性核酸探针技术,对其进行H9N2亚型禽流感病毒(H9N2AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽偏肺病毒(aMPV)、禽败血性支原体(MG)、鼻气管鸟杆菌(ORT)和大肠杆菌(E.coli)共感染情况的调查。【结果】421份发病肉鸡肺脏中,H9N2AIV、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT和E.coli的检出率分别为53.68%,68.41%,33.49%,54.87%,57.25%,9.02%和41.17%;且存在严重的共感染现象,共感染率高达90.26%,单一感染和阴性个体仅占7.36%和2.38%;发病肉鸡群中,7种呼吸道病原体2重、3重、4重、5重、6重、7重感染的检出率分别达19.48%,26.12%,27.32%,11.88%,4.51%和0.95%,以2重、3重和4重感染较为常见。而临床健康肉鸡肺脏中,H9N2AIV、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT和E.coli的检出率分别为12.50%,23.13%,5.63%,36.87%,21.88%,0%和16.88%;呈阴性和单一感染的样品分别占25.00%和43.75%;多重感染样品仅占31.25%,且主要为2重感染。7种病原体中,H9N2AIV、NDV、MG和E.coli在肉鸡呼吸道疾病的共感染中起重要作用。【结论】发病肉鸡和临床健康肉鸡均存在混合感染,但以发病鸡群更为严重和复杂;呼吸道病原体多重感染是导致肉鸡呼吸道疾病日益严重的重要原因。     

山枇杷基因组DNA的提取及自然群体内ISSR遗传多样性分析

为探究山枇杷基因组DNA提取方法及群体内个体之间的遗传多样性,以采自福建省戴云山脉九仙山山枇杷(Garcinia multiflora)自然群体的41份叶片样品为材料,比较2种改良十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)对其基因组DNA的提取效果,并通过简单序列重复区间—聚合酶链式反应(ISSR-PCR)扩增反应体系分析其群体内遗传多样性。结果表明,CTAB-2法通过适当提高CTAB浓度,添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和酚—氯仿—异戊醇,获得的基因组DNA纯度和质量较好;筛选的11条ISSR引物共扩增85个条带,其中多态性条带61条,占71.76%;NTSYS 2.10e软件设定阈值(GS)为0.78,该山枇杷样品归为4个类群,样品遗传相似系数介于0.588-0.929,平均为0.779,说明该群体的遗传基础较宽;利用STRUCTURE 2.2软件将样品分为4个类群,结合后验概率(Q值)分布表表明部分个体之间存在较丰富的遗传信息交流。