香蕉Actin1启动子的分离及启动活性的分析

从香蕉基因组DNA中分离香蕉Actin1启动子序列，序列测定结果表明，该片段1253bp，包含完整的G-box和TATA box，5’非翻译区和其下游的内含子，与文献报道序列的同源性达97．53％。以全长序列取代植物表达载体pCAMBIA3300上的35s启动子序列构建成瞬间表达载体pCAMBIA—Act1，以内含子序列Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切片段（584bp）取代植物表达载体pBI121上的35 S启动子，构建成瞬间表达载体pBI121-Act1-1。采用基因枪法对香蕉根、叶和果实的薄片进行转化，转化材料经培养3h，采用分光光度法测定各组织GUS的活性。结果表明，Actin1启动子在所转化的3种组织中均可启动报告基因的表达，表达活性与35 S启动子接近，具有组成型表达的特点。内含子部分序列（584bp）也具有启动活性，但启动活性较低。     

茶树花粉中丙酮酸脱氢酶(CsE1α)的定位分析及其启动子的克隆与表达

根据以往试验获得的Cs E1α的c DNA全长序列,利用TAIL-PCR克隆Cs E1α启动子。测序验证与生物信息学分析后发现,该启动子片段长336 bp,含有2个CAAT-box,2个TATA-box,2个GATA-box,1个LTR,1个G-box等顺式作用元件。构建载体转入洋葱内表皮细胞瞬时表达,启动子可启动下游报告基因,使荧光蛋白表达于整个细胞,表明所克隆的启动子具有启动功能。Cs E1α与GFP融合蛋白瞬时表达表明Cs E1α定位于线粒体。本实验为下一步转基因拟南芥稳定表达,进一步研究Cs E1α基因的表达调控,探讨茶树花粉抗寒的分子生物学机理奠定基础。     

龙眼Mn-SOD基因的表达及其启动子功能分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究龙眼Mn-SOD基因在应答非生物因子和外源激素处理下的转录情况,并利用烟草瞬时转化法分析其启动子的表达活性。结果表明:龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达受到红光和蓝光的抑制;而在白光处理下,Mn-SOD呈现先上升再下降的趋势,在绿光中,则是先下调再上升。在盐胁迫处理下,Mn-SOD基因的表达受到抑制,在蔗糖和不同天数处理中则不受影响。在一定浓度范围内,外源激素IAA、GA3、Me JA、SA和ETH均能诱导或抑制龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达,提示其参与外源激素的应答。构建4个不同启动子缺失片段驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果表明,龙眼Mn-SOD基因4个不同启动子缺失片段启动GUS基因的能力均低于Ca MV35S启动子,但均可启动GUS基因的表达。瞬时表达和定量表达结果显示,3’缺失的MSD-pro4(-669~-267 bp)启动GUS基因的能力最强,其次为5’缺失的MSD-pro1(-669~-1 bp),最弱的为MSD-pro2(-432~-1bp)和MSD-pro3(-267~-1 bp),提示Mn-SOD启动子-669~-432 bp区段内含有重要的正向顺式调控元件;而-432~-1 bp区段含有负调控元件。     

AtSDG8启动子区域功能元件的分析

启动子控制着基因表达的起始和程度,对基因的活动起着“开关”作用.为了深入了解基因SDG8的功能与特性,对SDG8启动子进行了初步的功能分析.以GUS作为报告基因,选取长度不同的两个启动子片段构建载体,转化到拟南芥中,获得转基因植株SLP和SSP.通过GUS基因的表达分析推测SDG8启动子的核心功能区域在-873～-2706 bp之间,这一结果为进一步研究SDG8基因的功能和结构打下了基础.     

高粱高效Ubiquitin启动子的克隆及活性鉴定

在转基因植物的研究中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一。植物泛素（ubiquitin）基因启动子以启动效率高、甲基化程度相对较低、遗传性状稳定等特点成为单子叶植物中应用较为广泛的启动子。其中，玉米的Ubi-1是最常使用的Ubiquitin启动子之一。本研究旨在克隆高粱高效Ubiquitin启动子，为高粱及其他单子叶植物的遗传转化研究提供新的组成型启动子选择。本研究从NCBI数据库中查找到多个polyubiquitin基因，下载其起始密码子上游3000 bp的序列。根据Ubiquitin启动子的特点，选择含有5′ UTR内含子且大小合适的序列，并通过在线启动子预测网站进行启动子分析，最后选择2个基因（LOC8076096、LOC8063786）进行启动子克隆，将其启动子序列分别命名为U1和U5。将这2个启动子片段PCR扩增后，连入含有GUS报告基因的植物表达载体Ubi-GUS，得到重组表达载体U1-GUS和U5-GUS。重组载体通过农杆菌介导法转化水稻和狗尾草，PCR筛选阳性转化苗，对阳性转化苗进行GUS染色分析，鉴定U1和U5的启动子活性。GUS染色观察发现，所有以U1和U5为启动子的水稻和狗尾草阳性转化苗的根、茎和叶均呈现较深的蓝色，比以玉米Ubi-1为启动子的阳性转化苗的蓝色略深，且以U5为启动子的阳性转化苗比以U1为启动子的蓝色更深，而非转基因的水稻和狗尾草小苗则完全染不上蓝色。因此，启动子U1和U5在水稻和狗尾草中均具有组成型强启动子的活性，可作为新的组成型启动子应用于高粱、水稻、狗尾草及其他单子叶植物的遗传转化研究。     

块根特异启动的木薯SBE Ⅰ、SBE Ⅱ基因RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

水稻异淀粉酶基因ISA1及其启动子的表达特性分析

 利用实时定量RT-PCR方法研究了水稻异淀粉酶基因ISA1在各组织及不同发育阶段籽粒中的表达模式,结果表明该基因只在发育籽粒中表达。同时,克隆了ISA1基因起始密码子上游1.1 kb和2.1 kb两个不同长度的启动子片段,并分别与GUS报告基因融合,经农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量结果表明,2.1 kb的ISA1启动子具有很好的胚乳表达特异性,与内源基因定量表达分析的结果一致;而1.1 kb的ISA1启动子则不具备该表达特性,它在胚乳、茎、茎节及谷壳中都有很高的表达。这可能是因为 2.1 kb启动子中含有抑制目的基因在茎等组织或器官中表达的顺式作用元件。     

利用RNAi技术沉默大麦B-Hordein基因的研究

为限制大麦籽粒中贮藏蛋白的积累,降低其蛋白质含量,以大麦幼胚为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将大麦B组醇溶蛋白基因gp4/antisense gp4片段与Ubi启动子相连导入大麦,经PCR检测证实,含有gp4反向重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入大麦。RT-PCR结果表明,转基因株系中B-Hordein mRNA积累受到明显抑制。收获T1代籽粒,经近红外谷物分析仪测定表明,2个转基因大麦株系籽粒蛋白质含量(分别为11.4%、11.7%)较对照(12.3%)降低。因此,利用RNA干涉技术降低大麦蛋白质含量是可行的。     

大豆GmGBP1基因启动子的光周期响应元件TCT-motif功能分析

GmGBP1基因的启动子的多态性位点SNP-796与生育期密切相关，SNP-796G为缩短大豆生育期的优异等位基因。本研究运用生物信息学手段分析发现，等位基因SNP-796 G→A变异会导致TCT-motif光效应元件的变异。将包括SNP-796位点的GmGBP1基因的启动子片段与Luciferase报告基因融合构建植物表达载体并转化烟草，结合烟草叶片中的农杆菌瞬时表达试验，分析了该启动子中TCT-motif顺式作用元件的功能。结果显示，TCT-motif受短日照条件诱导，引起Luciferase基因的表达显著上调。在短日照条件下，TCT-motif可能通过增加GmGBP1基因mRNA的表达量，从而缩短大豆品种的生育期。       

油菜种子特异表达启动子pNapB和pFAE1的结构与功能比较研究

启动子是基因在转录水平上的一种重要调控元件。本研究通过同源序列法从甘蓝型油菜品种中油821中分离到油菜基因NapB和FAE1的上游启动子序列pNapB和pFAE1,其中pNapB长1136bp,pFAE1长1420bp。两种启动子的核苷酸序列都含有种子特异表达启动子的顺式作用元件,包括RY重复、G-box和E-box等,但两种启动子顺式作用元件的序列分布不同。将pNapB和pFAE1两个启动子分别与报告基因GUS融合并通过农杆菌介导法导入烟草,得到大量转基因烟草植株。对T1代转基因烟草进行组织化学分析,比较了不同启动子的组织表达特异性。结果表明,两种启动子都只在种子中起作用,属于典型的种子特异性表达启动子,但是它们作用的时间和空间分布以及作用强度明显不同。pNapB启动子比pFAE1作用开始的时间早,持续时间长,在早期作用比pFAE1强,但pFAE1启动子在种子发育中期启动速度快,成熟种子的GUS染色深度在两种启动子间差别不大。     

青稞B组醇溶蛋白基因5′上游调控区的TAIL-PCR克隆及序列分析

为了阐明青稞种子中B组醇溶蛋白合成的遗传调控机制，为分子改良大麦和小麦籽粒品质奠定基础，以青稞品种Z09和Z26的基因组DNA为模板，根据已克隆的青稞B组醇溶蛋白（B-hordein）基因的5’端序列设计三个基因特异的反向引物，分别与随机简并引物配对，进行热不对称嵌套PCR（Thermal asymmetric interlaeed PCR，TAIL-PCR）扩增，从两份西藏青稞材料中分离克隆出2个B-hordein基因的上游调控序列。序列测定结果表明，两个扩增片段长度分别为395和396bp，加上已知B-hordein基因中的GSP2引物序列与翻译起始密码子之间198bp的长度，则可得到约600bp的B-hordein基因5’上游调控序列。将所得序列与Genbank中的三个贮藏蛋白基因的对应区段进行序列比对，所得序列与来自野生智利大麦（H．chil-ense）的B3-hordein基因（Genbank登录号：AY998010）、普通小麦（T.aestivum）的低分子量麦谷蛋白亚基基因（Genbank登录号：X07747）和栽培大麦（H．vulgare）的B-hordein基因（Genbank登录号：X03103）具有81％～95％的序列相似性。推测其TATAbox位于-80bp，CAAT-likebox位于-140bp处。另外，在-300bp处存在一个胚乳盒（EndospermBox，EB），包含EM基序和GCN4基序。EM基序高度保守，GCN4基序有一个核苷酸位点的突变。此外，在约-560bp处存在一个胚乳盒类似结构。     

匈牙利大麦品种遗传多样性的ISSR分析

为给大麦种质资源的利用提供分子生物学依据,以甘肃省育成大麦品种陇啤1号（XYL-601）为对照,利用内部简单重复序列多态性（ISSR）分子标记技术分析了来自匈牙利的30份大麦种质资源的多样性。在31份大麦种质资源中,12条ISSR引物扩增出112个条带,其中多态性条带比率（PPB）为82.14%,扩增产物片段大小在0.2～1.5kb之间。通过聚类分析,将供试大麦种质资源分为2大类。本研究结果表明,匈牙利大麦遗传多样性水平较高,可以引进利用,为甘肃大麦育种提供资源基础。     

利用SSR引物分析西藏青稞种质资源的遗传多样性

为了评价西藏青稞种质资源的遗传多样性,用260对SSR引物对来自青藏高原主要农区的75份青稞育成品种、17份野生大麦、39份青稞地方品种和44份国外大麦材料的遗传多样性进行了分析.结果表明,从260对SSR引物中筛选出23对多态性高的引物,占筛选引物的8.1％.23对SSR引物在西藏野生大麦中共扩增出稳定、清晰的条带92条,多态性条带为81条,其比例为88.04％;在西藏青稞地方品种中共扩增出稳定、清晰的条带89条,多态性条带为78条,其比例为87.6％;在青稞育成品种中共扩增出稳定、清晰的条带109条,多态性条带98条,其比例为89.9％;在引进材料中共扩增出稳定、清晰的条带64条,多态性条带53条,其比例为82.8％.遗传多样性分析结果为青稞育成品种(0.9882)＞西藏野生大麦(0.8033)＞西藏青稞地方品种(0.5820)＞国外大麦材料(0.4218).聚类与主坐标分析表明,实验材料可以清楚的分为4类,西藏野生大麦分在两个类群,西藏青稞地方品种分在两个类群,引进大麦材料分在一个类群,青稞育成品种分在四个类群.同一来源地区的青稞育成品种遗传基础较为狭窄,不同地区间的青稞育成品种遗传差异较大.以上结果说明,在西藏青稞新品种选育和遗传改良中,在发掘和利用西藏野生大麦资源、西藏青稞地方品种资源的同时,更应该加强不同地区青稞育成品种资源的交换和配合使用.     

水稻精细胞优势表达基因RSG6启动子的克隆及表达

利用已知的[i]RSG6[/i]基因序列和GenBank中提供的[i]RSG6[/i]前导序列设计引物,通过基因组DNA的PCR扩增得到长度为1 408 bp和1 173 bp的两个[i]RSG6[/i]启动子片段PB、PS,测定序列分析发现,PB、PS分别位于水稻第10和第4染色体上,PB、PS序列之间具有较高的同源性,且都含有大量的启动子元件。通过设计带有酶切位点的引物扩增出PB和PS的各两条缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2,与质粒pBI221连接后得到中间载体pBI221 PB1、pBI221 PB2、pBI221 PS1、pBI221 PS2,再与质粒pBIN19连接构建出双元表达载体pBIN GUSB1、pBIN GUSB2、pBIN GUSS1、pBIN GUSS2,转化农杆菌EHA105,感染烟草叶片和烟草花粉,瞬时表达显示缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2均具有启动子功能,且PB1、PS1的启动效率较PB2、PS2高。     

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

利用SSR标记技术检测玉米杂交种纯度

对玉米子粒DNA提取、SSR扩增片段检测方法等进行了研究,并以4个利用常规种子贮藏蛋白质电泳技术难以鉴定纯度的玉米杂交种及相应自交系和9对玉米SSR位点引物为材料,分别筛选出适合这些不同杂交种纯度鉴定的SSR位点引物,建立了一套利用SSR标记进行玉米杂交种纯度鉴定的技术规程.该程序包括从粉碎干种子提取DNA和利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离SSR扩增片段,对仪器设备要求较低、简单、快速,易于推广。     

利用REF启动子构建橡胶树乳管特异表达载体及GUS基因的瞬时表达

采用SDS法提取橡胶树基因组DNA,用2套引物进行PCR扩增,得到2条REF条带,它们与NCBI报道的REF序列间的同源性分别是98.9%,98.4%.用克隆得到的REF片段分别替换载体质粒pBI121中的CaMv35S启动子,得到利用橡胶内源性启动子构建的橡胶树REF启动子瞬时表达载体（pBIR1和pBIR2）.用基因枪法转化橡胶树组培苗叶片后,Gus组织化学检测显示叶脉为Gus染色阳性.研究中发现,长度为306bp的REF启动子片段可以实现REF启动子的全部功能.从而成功地构建了橡胶树乳管瞬时表达载体,为外源基因的橡胶树乳管特异表达载体的构建打下了基础.     

水稻叶绿体基因组定点表达载体的构建及增强型绿色荧光蛋白原核表达分析

分别克隆了水稻叶绿体基因组同源重组片段trnI和trnA、具有3种不同核糖体结合位点(RBS)序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)、来自烟草叶绿体的16S rRNA基因启动子Prrn和psbA基因终止子TpsbA,将上述元件通过酶切位点依次连接到质粒pUC19上,构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体基因组定点整合表达载体pIA - EGFP1、pIA - EGFP2和pIA - EGFP3.进行分子检测验证后,对上述载体进行了大肠杆菌EGFP原核表达检测,结果携带来源于λ噬菌体T7基因10的5′端非翻译区的载体pIA - EGFP3荧光最强,适合用于水稻叶绿体转化.     

Development and Application of SCAR Markers for Discriminating Cytoplasmic Male Sterile Lines from Their Cognate Maintainer Lines in Indica Rice

The DNA fragments about 1 600 bp were amplified using random amplified polymorphism DNA (RAPD) primer OPA12 with the templates of mitochondrial DNA of Zhenshan 97A and Zhenshan 97B,and were sequenced.The nucleotide sequences and lengths of the fragments from Zhenshan 97A and Zhenshan 97B showed no difference.The precise length of the fragment was 1 588 bp.Sequence characterized amplification region (SCAR) primers were then developed to discriminate the cytoplasmic male sterile (CMS) lines and their maintainer lines.A specific 1 588 bp fragment could be amplified with SCAR primers,CHI19F2/CHI19R2 and CHI20F3/CHI23R3,in the mitochondrial DNA of Zhenshan 97A,but not Zhenshan 97B.Furthermore,the specific fragment could be also amplified from the total DNA from green leaf tissues of Zhenshan 97A with SCAR primers,but not Zhenshan 97B.With the corresponding primers,the specific fragment could also be amplified from the total DNA of green leaves of other two CMS lines with wild abortive type cytoplasm (CMS-WA),namely Zhenpin A and Tianfeng A,but not in their maintainer lines.Moreover,using total DNA as template,each of the four pairs of SCAR primers could also be used to amplify the 1 588 bp fragment in CMS-ID (Indonesia paddy type) line Ⅱ-32A,but not in II-32B,and the specific fragment was amplified from the DNA of both F1 and F2 seedlings of Shanyou 63.The results of detecting the genetic purity of a man-made mixture of the seeds of Zhenshan 97A using CHI20F3/CHI23R3 were completely consistent with the phenotypes.Taken together,these results indicated that the specific 1 588 bp-fragment amplified by CHI20F3/CHI23R3 was the unique amplification products of CMS mitochondrial DNA,and could be used to distinguish CMS-WA and CMS-ID lines from their corresponding maintainer lines at the seedling stage.