耐氟喹诺酮类病原菌gyrA基因突变的寡核苷酸芯片检测

根据大肠杆菌、沙门菌、无乳链球菌和鸡毒霉形体的gyrA基因序列，设计了通用引物和ll条寡核苷酸探针；利用点样仪将探针点在基片上，制成寡核苷酸芯片；采用PCR荧光标记靶基因，与芯片杂交，用荧光扫描仪检测信号；同时以PCR一测序法进行gyrA基因突变的检测。结果，PCR反应体系能特异性地扩增出靶基因；寡核苷酸芯片能同时检测不同病原菌GyrA第83、87位发生的突变，芯片检测结果与测序结果较为一致。结果表明，使用寡核苷酸芯片技术检测病原菌耐氟喹诺酮类基因突变是可行的；研究结果为基因芯片技术应用于兽医临床耐药性检测提供了基础。     

细菌基因突变的研究进展

细菌的基因突变是指细菌遗传物质的结构发生突然而稳定的变化 ,导致的变异可遗传于后代〔1〕。由于细菌借助无性双分裂的方式进行繁殖 ,因此所有后代的基因组通常都是完全相同的。尽管ＤＮＡ复制过程十分精确 ,但是后代细菌中偶然不常见的不精确性会使核苷酸的序列发生轻微的改变 ,导致基因的变异 ,一般突变的比例为 10∶4～ 10∶9〔2〕。在细菌细胞的数千个基因中 ,其任何一个均有可能发生突变 ,而同一基因的不同突变可能会在细胞中产生不同的效应 ,因此 ,可能突变的数目是很大的。即使是一个“纯的”细菌培养物也将含有许多不同的突变 ,对…     

禽蛋胚胎检测技术进展

禽蛋胚胎检测技术随着孵化厅自动化技术的发展而蓬勃发展,文章就光照检测、成像检测、激光检测、心跳检测、X光检测等各种禽蛋胚胎检测技术做了分析和总结,并对禽蛋检测技术的发展做了展望。     

免疫荧光检测技术及其在寄生虫检测中的应用进展

免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是在生物化学、显微镜技术和免疫学基础上发展起来的一项检测技术,是用荧光标记的抗体或抗原与被检样品中相应的抗原或抗体结合,在显微镜下检测荧光,并对样品进行分析的方法。它把显微镜技术的精确性和免疫学检测的特异性、敏感性有机地结合在一起。这一方法的特点是特异性强、灵敏度高。作为一种快速诊断方法,目前广泛应用于病毒、细菌病的诊断,也是许多动物寄生虫病(如弓形虫病)的常规诊断方法。随着标记抗体、抗原的普及,免疫荧光技术在寄生虫病诊断方面的应用将更加广泛。     

食品与饲料加工过程中转基因作物的检测技术进展

1引言转基因作物是指利用重组DNA技术将外源基因整合于受体植物基因组,改变其遗传组成后产生的植物及其后代,也称为遗传修饰生物体(Geneticallymodified organisms,GMOs)。自1983年首例转基因植物——转基因烟草问世以来,全球转基因作物的种植面积和销售收入均以倍数增长。全球转基因作物的种植面积2005年达到9000万公顷,其中大部分种植在美国、加拿大和阿根廷。从转基因作物种类来看,转基因大豆占60%左右,其次是转基因玉米和棉花。我国大豆年产量仅次于美国、巴西和阿根廷,居世界第四,2003年大豆产量约1620万吨。但是,国产大豆仍远不能…     

新型检测技术在犬猫主要病原检测中的应用进展

犬猫传染性疾病严重影响犬、猫健康，甚至威胁人类生命健康。随着新型材料和科学技术的发展，在传统检测方法的基础上建立了多种快速、灵敏、特异的检测技术。针对研究较多的快速检测方法如等温扩增技术、基因芯片技术、时间分辨免疫荧光层析技术以及免疫微球分离检测技术等多种新型检测技术，从检测时间、优缺点及在犬猫主要病原检测的研究进展等多角度予以综述，旨为在不同的检测环境下选择适合犬猫病原检测技术及产品研发提供参考。     

耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌基因突变的MAMA-PCR检测

采用MAMA-PCR法对72株已知突变菌株的突变情况进行了检测。结果，有2种gyrA83位突变：TCG→TTG和TCG缺失；4种gyrA87位突变：GAC→AAC、GAC→GGC、GAC→TAC和GAC→CAC；1种parC80位突变：AGC→ATC以及4种parC84位突变：GAA→AAA、GAA→GCA、GAA→GGA和GAA→GTA。采用同样的方法，对38株未知突变菌株的检测结果显示，gyrA83、gyrA87、parC 80和parC84位的突变检出的正确率分别为97．4％、94．7％、81．6％和94．7％。结果表明，MAMA-PCR有望成为监测耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌的分子生物学常规方法。     

毒理学致突变检测的分子生物学技术

近年来建立起来的一些分子生物学技术，如DNA测序、突变检测，基因损伤评价等，为危害物的安全性毒理学评价开辟了新的途径。本文就其方法、应用及前景作了综述。     

BMPR-IB基因突变与绵羊繁殖性能的研究进展

近年来有关BMPR-IB基因fecB突变的染色体定位和影响排卵率的机制以及影响绵羊繁殖性状的主基因的研究报道很多。本文简要介绍一下近年来有关这些方面的研究,以期为今后的研究工作提供参考。     

鼠痘病毒检测方法的进展

鼠痘是由鼠痘病毒引起的实验小鼠的一种烈性传染病。本病多呈暴发性流行 ,致死率较高 ,常造成全群淘汰 ,危害极大。临床表现以四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征 ,故又称脱脚病。鼠痘病毒的感染一般分为急性感染、慢性感染、潜伏感染。急性感染表现为健康小鼠在一出现症状的几小时内就死亡 ,不能检测到抗体 ,剖检有广泛的肝、脾坏死灶。慢性感染表现为鼠群中有散在的小鼠死亡 ,临床症状为脚、尾、鼻端及耳下有溃疡性病灶。剖检有肝脾肿大、白色斑点状坏死灶、淋巴结肿大 ,肾有充血灶和坏死灶。此时抗体已产生 ,能检测到高滴…     

基因芯片及其在病原微生物检测中的应用

基因芯片是近年来迅速发展的一门生物高新技术,它以其能够快速、高效、大规模地同步检测生物遗传信息的卓越功能而得到发展。在基因测序、基因表达分析、药物筛选、基因诊断等领域显示出重要的理论和实用价值。作者就基因芯片技术的原理、技术要点以及在病原微生物检测中的应用作一综述。     

山羊BMP15基因FecX-L突变的检测

采用PCR-SSCP方法在高繁殖力山羊品种（济宁青山羊、波尔山羊和文登奶山羊）和低繁殖力山羊品种（内蒙古绒山羊、安哥拉山羊和辽宁绒山羊）中检测骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因的FecX-L突变,同时研究该基因突变对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明这6个山羊品种都没有发生与Lacaune绵羊相同的FecX-L突变（C53Y）。可见BMP15基因中影响Lacaune 绵羊高繁殖力的突变位点对济宁青山羊的高繁殖力没有显著影响。     

金黄色葡萄球菌临床分离耐氟喹诺酮类药物株的gyrA和grlA基因突变

对 5株临床分离的耐氟喹诺酮类药物的金黄色葡萄球菌 (MIC值范围 :4～≥ 12 8mg/ L) ,提取各细菌染色体DNA,对 gyr A和 grl A基因进行 PCR扩增 ,产物与 p MD18- T载体连接 ,转化至大肠杆菌 JM10 9感受态细胞 ,筛选阳性克隆 ,测序。序列分析结果表明 ,5株菌均发生了基因突变。突变位点 grl A:Ser80 (TCC)→ Phe(TGC) ,Ser80 (TCC)→ Tyr(TAC) ;gyr A:Ser84 (TCA)→ L eu(TTA )、Ser84 (TCA)→ Ala(GCA)、Glu88(GAA)→ L ys(AAA) ,其中 2株对氟喹诺酮类药物的 MIC值低 (4～ 6 4 m g/ L) ,均发生 grl A单一点突变 ,其余 3株在 gyr A和 grl A上产生多突变位点 ,且对氟喹诺酮类药物的 MIC值较高 (8～≥ 12 8mg/ L )。说明单一的点突变只能引起低水平或中等水平的耐药 ,高水平的耐药需要多位点的突变。 5株耐药菌株均发生 grl A Ser80→ Tyr(Phe)点突变 ,提示环丙沙星、诺氟沙星等氟喹诺酮类药物作用于金黄色葡萄球菌的首要靶酶是拓扑异构酶 Iv     

耐氟喹诺酮类药物大肠杆菌基因突变耐药机制的研究

取临床分离的 4株耐药菌、实验室诱导培养获得的 3株耐药菌和 1株敏感菌 ,提取其染色体 DNA,PCR扩增 gy-r A和 par C基因片段 ,并将其克隆和测序。结果表明 ,无论是临床分离的还是实验室诱导的耐药菌 ,gyr A基因在其编码第 83位或第 87位氨基酸处均发生突变 ,par C基因在其编码第 80位或第 84位氨基酸处发生突变 ,而敏感菌 ES在2个基因位点上均未发生突变。其中 2株低度耐药菌株的 gyr A基因出现单一突变 ,使其编码的氨基酸发生改变 ,分别为 Ser83→ L eu或 Asp87→ Asn,但在 par C基因上却未发生突变 ;其余 5株高度耐药菌 gyr A基因突变导致氨基酸发生改变 :Ser83→ L eu(n=5 ) ,Asp87→ Asn(n=4 )和 Tyr(n=1) ,par C基因突变导致氨基酸改变 :Ser80→ Ile(n=4 )和Glu84→ L ys(n=1)。这 2个基因的突变均与文献报道的突变相同 ,表明 gyr A基因 Ser83和 Asp87突变以及 par C基因 Ser80和 Glu84突变可能与大肠杆菌的喹诺酮类药耐药机制有关 ,且低度耐药只在 gyr A基因上出现单一位点突变 ,当高度耐药时 ,才同时在 par C基因上出现突变     

山羊生长分化因子9基因FecTT突变检测

本研究采用PCR-RFLP方法检测生长分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF9)基因FecTT突变在济宁青山羊、贵州白山羊、大足黑山羊、陕南白山羊、古蔺马羊、马头山羊、波尔山羊、成都麻羊、萨能奶山羊、文登奶山羊、板角山羊、金堂黑山羊、关中奶山羊、川东白山羊、安哥拉山羊、辽宁绒山羊、内蒙古绒山羊等17个山羊品种中的分布。结果表明,在17个山羊品种中都未检测到FecTT突变,提示,GDF9基因影响Thoka绵羊高繁殖力的FecTT突变对以上17个山羊品种的繁殖力均没有显著影响。     

利木赞牛抑肌素基因Q204X及nt821突变快速检测方法

抑肌素(GDF8)是骨骼肌细胞生长的重要负调控因子。抑肌素基因突变是牛"双肌"性状形成的分子遗传基础,在不同牛品种中存在着不同的抑肌素基因突变类型,在利木赞品种中,"双肌"性状主要是抑肌素基因第2外显子的Q204X型突变及第3外显子nt821突变。本研究报道一种新的检测该突变的简便方法。应用突变型与正常型引物在一次PCR反应中同时检测出不同的等位基因。对Q204X突变型PCR产物克隆测序分析表明,该片段确实含有一个能导致抑肌素功能缺陷的Q204X突变。     

利木赞牛抑肌素基因Q204X及nt821突变快速检测方法

抑肌素(GDF8)是骨骼肌细胞生长的重要负调控因子.抑肌素基因突变是牛"双肌"性状形成的分子遗传基础,在不同牛品种中存在着不同的抑肌素基因突变类型,在利木赞品种中,"双肌"性状主要是抑肌素基因第2外显子的Q204X型突变及第3外显子nt821突变.本研究报道一种新的检测该突变的简便方法.应用突变型与正常型引物在一次PCR反应中同时检测出不同的等位基因.对Q204X突变型PCR产物克隆测序分析表明,该片段确实含有一个能导致抑肌素功能缺陷的Q204X突变.     

碱基编辑器介导的猪IGF2基因高效定点突变

本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast cells,PFFs）中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2,IGF2）进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型。结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3 072 bp处的单核苷酸多态性（SNP）位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列。单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间。将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染至猪胎儿成纤维细胞中,对混合细胞编辑效率进行检测结果表明,对于IGF2基因靶点,hA3A-BE3系列碱基编辑器C到T的编辑效率显著高于rA1-BE3（P<0.05）。流式分选、单克隆细胞培养及鉴定结果表明,虽然有71.43%的hA3A-BE3单克隆细胞已被编辑,但有42.86%的细胞存在插入和缺失（indels）;hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率（56.86%和40.38%）虽低于hA3A-BE3（71.43%）,但是indels的效率也较低（31.37%和21.15%）。测序结果分析表明,利用碱基编辑器高效筛选到IGF2基因靶点纯合点突变的单克隆细胞。碱基编辑器作为新的基因编辑工具,可以对猪基因组中与经济性状关联的SNP位点进行高效、精确的基因修饰,为加速猪经济性状的遗传改良提供理论与实践基础。     

Efficient Site-directed Mutation of Porcine IGF2 Gene via Base Editors

This study was aimed to efficiently and accurately edit the growth trait-related gene insulin-like growth factor 2 (IGF2) in porcine fetal fibroblasts cells (PFFs) of Bama pigs using base editors.The IGF2 gene sequences of Bama pigs and Large White pigs were identified by PCR amplification and sequencing,and the expression vector of sgRNA-IGF2 targeting Bama pigs was constructed.Then the editing efficiency and product types at IGF2 gene via different base editors were studied by cell transfection,detection of mixed cell editing efficiency,screening of single cell colonies and genotyping.The results showed that there was a single nucleotide polymorphism (SNP) site at 3 072 bp in intron 3 of IGF2 gene between Bama pigs and Large White pigs,and a single-stranded oligonucleotide sequence targeting the IGF2 gene was designed.The single-stranded oligonucleotide was annealed and ligated with the BsaⅠ-linearized pGL3-U6-sgRNA plasmid to construct the sgRNA-IGF2 expression plasmid.The sequencing results of the recombinant plasmid showed that the sgRNA sequence was accurately inserted between the U6 promoter and the sgRNA scaffold.Four different cytosine base editors (rA1-BE3,hA3A-BE3,hA3A-BE3-Y130F and hA3A-eBE-Y130F) were co-transfected with sgRNA-IGF2-expressing plasmid into PFFs,respectively.The editing efficiency in mixed cells showed hA3A-BE3-based CBEs could introduce higher efficiency of C-to-T mutation than rA1-BE3 (P<0.05).The results of flow cytometry,single cell culture and genotyping showed that 71.43% of single cell colonies were mutant in hA3A-BE3 group,but 42.86% of them had insertions/deletions (indels).The editing efficiency of hA3A-BE3-Y130F (56.86%) and hA3A-eBE-Y130F (40.38%) were lower than hA3A-BE3(71.43%),but the indels of them were also lower (31.37% and 21.15%).In addition,single cell colonies with homozygous mutation at IGF2 gene site were achieved by base editors in this study.Base editors,as new gene editing tools,could efficiently and accurately modify SNP associated with economic traits in pig genome and accelerate genetic improvement.     

脂蛋白分解酶基因(LPL)及其与家畜胴体品质的关系

脂蛋白分解酶作为一个在脂肪分解、转运、沉积中发挥重要作用的水解酶,其基因多态性对动物机体起着至关重要的作用。LPL基因的异常可导致动物机体出现不同程度的生理病理变化。近年来研究发现,哺乳动物LPL基因可以作为遗传标记基因。综述了家畜LPL基因的生物学功能及其与胴体品质关系方面的研究进展,以期为进一步揭示该基因的生物学功能以及充分发挥其在提高家畜胴体品质中的作用提供科学依据。