新城疫鹅胚化La Sota克隆毒株的生物学特性研究

用蚀斑克隆技术证明,新城疫鹅胚化 La Sota 疫苗株系由大、中、小三种蚀斑构成的异质性(?)毒群体.经鹅胚成纤维细胞(GFE)4～5次克隆后,获得了三个克隆株(LG LM 和 LS),在鹅胚及 GEF 上多次传代后,LM和 LS 克隆株的蚀斑形态保持稳定,而 LG 克隆株则出现大小不同的蚀斑.经最小致死量(MLD)、平均致死时间(MDT)等试验表明,此三株之间存在毒力差异.通过血凝素解脱速率等试验还表明,这三个克隆株在生物学特性上也有差异.     

鸡新城疫病毒的分离鉴定与交叉免疫保护试验

为了评价疫苗免疫保护效果,进而筛选出最佳的免疫方案,将分离到的鸡新城疫病毒(Newcas-tle disease virus,NDV)流行毒株制备成灭活疫苗进行交叉免疫保护试验研究。把采集到的疑似发生新城疫的病鸡肺、气管环等组织经处理后接种10日龄SPF鸡胚进行病毒的分离和增殖,并用血清学和分子生物学方法进行毒株的鉴定;用分离到的NDV/Chicken/TC/1/2011毒株制成油乳剂灭活苗,与La Sota疫苗以不同的疫苗组合免疫SPF鸡,进行交叉免疫保护试验。结果显示,共分离到9株新城疫病毒,其F蛋白裂解位点的氨基酸均为112 R-R-Q-K-R-F117,表现为强毒株的分子特征,与致病指数结果一致。分离株灭活苗组和分离株灭活苗+La Sota弱毒苗对试验鸡的免疫保护力最高,其次是La Sota灭活苗+La Sota弱毒苗和LaSota灭活苗,La Sota弱毒苗对试验鸡的免疫保护力最低。NDV分离株与疫苗株La Sota存在明显抗原性差异,这将对新城疫疫苗的发展和疾病控制策略制定至关重要。     

新城疫蚀斑克隆毒间抗原关系的研究

用蚀斑克隆化技术对分离自黑龙江省不同地区免疫鸡群的新城疫病毒HN_7和HN_2株进行蚀斑纯化,获得了各自性状较为一致的三种蚀斑克隆毒。对La Sota疫苗毒采用促蚀斑形成方法获得了性状稳定、一致的混浊小蚀斑。对三种克隆毒之间以及和La Sota疫苗毒间做交叉蚀斑减数中和试验,探讨各病毒之间的抗原关系.结果表明.不同毒株的蚀斑类型及比例不同;来源于不同毒株的各蚀斑克隆毒间存在着抗原差异,来源于同一毒株的不同蚀斑克隆毒之间无明显抗原差异:三种克隆毒和La Sota疫苗毒之间存在着程度不同的抗原差异。     

鸡新城疫及传染性法氏囊病二联油乳剂灭活苗的试制与应用

应用新城疫 ( ND)疫苗株 I系及 La Sota株、传染性法氏囊病 ( IBD)疫苗株 B87及自然强毒株制备成二联油乳剂灭活苗 ,通过免疫试验及区域试验 ,结果表明 ,疫苗安全可靠 ,免疫原性强 ,免疫鸡群一周后产生免疫力 ,3周后产生坚强免疫力 ,获得良好保护。受到用户好评。1　材料与方法     

两株生物学特性不同的新城疫病毒La Sota毒株诱导DF-1细胞天然免疫反应的比较

为探讨两株不同生物学特性的新城疫病毒La Sota毒株(La Sota参考毒株AV1615;La Sota突变株P2M1)引起的宿主天然免疫反应的差异,将两个毒株分别感染鸡胚成纤维细胞(DF-1),Real-time PCR及Western blot检测TLR3、TLR7、MDA5等受体的mRNA及蛋白表达;ELISA及免疫荧光检测细胞核转录因子IRF3的含量及其磷酸化水平;蛋白芯片检测40种细胞因子的分泌水平,并用ELISA验证部分与炎症、抗病毒等相关的细胞因子在细胞上清中的含量差异。结果显示,La Sota参考毒株AV1615感染细胞后,诱导产生的TLR3、TLR7、MDA5的mRNA及蛋白含量显著高于La Sota突变株P2M1(P0.05)。La Sota感染细胞后12 h,IRF3及其磷酸化水平、细胞上清中大部分细胞因子(31/40)的表达高于P2M1感染组。结果说明,两株La Sota毒株在诱导DF-1细胞的天然免疫反应方面存在差异,这可能是La Sota P2M1在鸡胚中更容易增殖的原因。     

疫苗免疫压力下新城疫病毒的动态演化

国内大量新城疫病毒(NDV)血凝素基因F和HN的测序表明,NDV主要免疫原HN和F基因与生产中广泛应用的经典疫苗La Sota株的核苷酸同源性不足80%,而NDV流行株之间则高达94.4%～100%,从分子遗传学角度证实了VIId型NDV是导致新城疫免疫失败的重要原因。HI交叉抑制和鸡胚中和试验等则从抗原性的角度证实了NDV在免疫压力下抗原性的变化,尽管NDV不同毒株间抗原性变异的程度已出现明显差异,但仍局限在同一个血清型中。     

经鸡胚感染的ALV-J对新城疫弱毒疫苗免疫的抑制作用及疫苗株对病毒载量的影响

为了解经鸡胚感染携带J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的雏鸡体内ALV-J对新城疫(ND)弱毒疫苗(La Sota株)免疫的抑制作用以及疫苗免疫后增强ALV-J对雏鸡致病作用的可能性,随机选择50个SPF鸡胚经卵黄囊接种模拟ALV-J感染,同时选取等量SPF鸡胚以相同方式接种PBS作为对照。出雏后于接毒组和对照组各取20只SPF鸡在7日龄时免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)。2～6周龄时,记录各组鸡的体重和免疫器官指数,并对雏鸡的NDV抗体水平和血液ALV-J病毒载量进行动态检测。结果显示,感染ALV-J的SPF鸡5、6周龄时体重显著低于PBS对照组(P0.05),而感染ALV-J再免疫新城疫弱毒疫苗后SPF鸡体重进一步降低(P0.05);与PBS对照组相比,6周龄时感染ALV-J的SPF雏鸡胸腺萎缩和脾脏肿大(P0.05),免疫新城疫弱毒疫苗后胸腺和脾脏损伤加剧(P0.05);3、4周龄时感染ALV-J再免疫ND弱毒疫苗组的雏鸡NDV抗体水平极显著低于仅免疫ND弱毒疫苗组(P0.01);4周龄时免疫弱毒疫苗后的SPF鸡血液中ALV-J病毒载量高于未免疫组(P0.01)。研究表明,感染ALV-J的雏鸡在免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)后增强了ALV-J对SPF雏鸡的致病作用,提示净化种源的重要性。     

新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒M41株低免疫鸡胚同胚培养研究

为研究新城疫病毒(NDV)La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株在低免疫鸡胚中进行同胚接种培养的可行性,通过将不同稀释倍数的La Sota株和M41株接种同一低免疫鸡胚,分别测定收获尿囊液La Sota株和M41株含量,确定最佳的稀释倍数以及适宜的培养温度和培养时间。结果显示:La Sota株和M41株以10 000∶5 000的比例稀释,培养96 h病毒含量和收获量最佳,La Sota株含量可达到109.17EID50/0.1 m L,HA效价为1∶1 024,M41株含量可达到106.50EID50/0.1 m L。接种后孵育温度为36.5℃时,每胚收获量比37℃培养增加了1.0～1.2 m L。按照此工艺生产病毒制备疫苗免疫SPF鸡,NDV和IBV抗体均符合国家标准要求。试验探索并优化了La Sota株和M41株在低免疫鸡胚中同胚接种的培养条件,为大规模抗原生产提供数据支持。     

近年来典型ND分离株的致病性和抗原性变异研究

8株ND分离株经过毒力测定(MDT小于47h；ICPI大于1．65)均属于NDV强毒，交互凝集抑制试验表明：分离株与C30和48株在HI效价上差1～3个滴度；攻毒试验表明不同毒株致病性明显不同；鸡胚中和试验则表明，La Sota单因子血清对分离株有中和作用，但中和滴度有明显差异。     

基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究

旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。结果显示,4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围,且PLK-N-06株毒力最强;F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。遗传进化分析表明,分离株均为Ⅶd亚型。交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显著的抗原性差异。用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI抗体效价几何平均值为1∶338,显著高于La Sota疫苗(1∶69),且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性,为新城疫基因Ⅶ型新型疫苗的研发奠定了基础。     

鸡新城疫病毒SXWN株的分离鉴定与基因分型

为了调查陕西省渭南市某鸡场新城疫高抗体蛋鸡群出现产蛋率下降及神经症状的原因,试验采用鸡胚接种、血凝-血凝抑制试验和RT-PCR技术对其进行了研究。结果表明:分离得到一株新城疫病毒,命名为SXWN株;对SXWN株进行毒力测定,鸡胚半数致死量(ELD 650)为1×108./0.1 mL,鸡胚最小致死量的平均致死时间(MDT)为52 h;通过F基因主要功能区片段克隆测序发现,SXWN株与我国常用的疫苗B1、La Sota株的核苷酸同源性仅为83.4%和83.7%,相应的氨基酸序列同源性均为85.4%;进化树分析发现,SXWN株属于基因Ⅶ型毒株;F蛋白裂解位点为112RRQ↓KRF117,符合新城疫强毒株的裂解位点特征。说明分离得到的SXWN株为基因Ⅶ型新城疫强毒株。     

鸡群加强免疫新城疫活疫苗(CS2株)与灭活苗(La Sota株)的效果对比

为了比较新城疫活疫苗(CS₂株)与灭活苗(La Sota株)对鸡群的加强免疫效果,本试验对首次已饮水免疫过新城疫弱毒苗的鸡群,再次用新城疫活疫苗(CS₂株)与灭活苗(La Sota株)分别进行加强免疫,采用血凝抑制试验方法检测新城疫免疫抗体,并作对比分析。结果显示：加强免疫使用灭活苗(La Sota株)比用活疫苗(CS₂株)的免疫合格率更高,免疫效果更理想。     

免疫鸡血清新城疫病毒抗体水平与攻毒保护效果的相关性研究

为了明确不同血清新城疫病毒(NDV)抗体水平对鸡的保护效果,本研究采用重组NDV灭活疫苗(A-Ⅶ株)对鸡进行免疫,通过交叉血凝抑制(HI)试验比较A-Ⅶ株与La Sota株间的血清学差异,并采用NDV标准强毒株F₄₈E₈和基因Ⅶ型强毒株JSC0804对不同抗体水平免疫鸡进行了攻毒保护试验。结果显示：抗A-Ⅶ株血清用A-Ⅶ株抗原测得的平均HI抗体效价显著高于La Sota株抗原(P<0.01),约高1.5log2,而抗La Sota株血清用La Sota株抗原测得的平均HI抗体效价稍高于A-Ⅶ株抗原,但无显著差异(P>0.05),表明2种疫苗株存在一定的血清学差异。在试验条件下,所有免疫鸡经点眼滴鼻攻毒后均未表现明显临床症状,但存在不同程度的排毒现象,排毒率总体上随抗体效价升高呈逐渐下降趋势。A-Ⅶ株疫苗免疫鸡血清HI抗体效价分别达≥13log₂和≥14log₂时可完全阻止F₄₈E₈株和JSC0804株排毒。免疫鸡排毒一般仅限于攻毒后5 d内。本...     

鸡新城疫流行毒株与标准毒株的交叉免疫保护试验

用新城疫(ND)分离强毒油佐剂灭活苗和NDV La Sota油佐剂灭活苗分别免疫母源抗体平均为2 log2的12日龄公雏。免疫后每隔1周采集血清，用微量血凝抑制试验检测HI抗体。免疫后21 d抗体水平达到峰值，抗体水平在6log2以上，维持30 d以上。免疫40 d后，用ND分离强毒株和NDVF48E9分别进行攻毒试验，2种疫苗的保护率均为100％，攻毒结果表明，ND分离强毒株和NDVF48E9株的免疫原性差异不显著。     

ND La Sota毒种在SPF鸡胚中增殖规律初探

为了探索ND La Sota弱毒株在SPF鸡胚中的增殖规律,保证生产用种毒的质量,我们采用不同的时间段来收获ND La Sota弱毒株感染的胚液,然后测定胚液的EID50。结果发现,SP鸡胚在接种病毒后85~100h之间出现死亡高峰期,经病毒含量测定,该时段感染胚液比其他时间死亡的感染胚液病毒含量高出1.5~6倍以上,表明ND La Sota弱毒株的增殖高峰与SPF鸡胚接种后的死亡时间有重要关系。     

一株鸡新城疫病毒的分离鉴定及HN基因的序列分析

为了检测引发昆明地区某鸡场鸡群疑似新城疫(ND)的毒株基因型,试验将采集到的疑似ND病料接种至9日龄鸡胚尿囊腔,对鸡胚尿囊液进行血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验和RT-PCR鉴定,对RT-PCR扩增产物进行克隆、测序,然后分析HN基因编码区序列同源性及绘制遗传进化树。结果表明:HA试验凝集价为1∶2~8,HI试验凝集价为1∶2~5,禽流感病毒(AIV)的HI试验均为阴性,初步鉴定分离株为新城疫病毒(NDV),将其命名为KM-16;RT-PCR扩增出的目的条带大小为1 759 bp;KM-16分离株与China-Guangxi14-2002和Japan-SG106-1999的HN基因的同源性为98.6%和98.7%,与经典毒株F48E9和La Sota C5的HN基因的同源性为84.7%和81.9%,与其他参考毒株的HN基因的同源性在95.2%～96.4%之间;KM-16毒株与China-Guangxi14-2002和Japan-SG106-1999等基因Ⅶ型毒株处于同一进化分支上。说明KM-16分离株为基因Ⅶ型NDV毒株。     

鸡减蛋综合征和新城疫二联油佐剂灭活苗的制备及应用

将减蛋综合征(EDS-76)H株和新城疫(ND)La Sota弱毒株分别接种鸭胚和鸡胚,收获胚液(HA价分别达2~(15)和2~(11)以上),福尔马林灭活后配制成EDS-ND二联油佐剂灭活苗。经无菌与安全性检验,免疫效力测定和田间应用结果表明,该苗安全性良好,于蛋鸡开产前1个月左右皮下或肌肉注射0.5ml/羽,免疫后21天HI抗体效价均达1:2~(10)以上,免疫期达6个月以上。     

鸡新城疫病毒分离鉴定及鸡胚免疫的方法研究

为了研究本地NDV毒力情况以及建立鸡胚免疫的方法,通过在山西地区采集病料,对病料通过PCR鉴定后应用SPF鸡胚繁殖,而后对其毒力相关的F基因进行扩增和序列分析。对其进行生物学毒力测定,并进行了动物回归试验。测定病毒效价,并将其稀释至不同的效价水平,接种于SPF鸡胚,进行鸡胚免疫方法的研究。结果,成功分离到1株NDV。其与Clone30、La Sota等株的同源性较高,与VG/GA、Clone30和La Sota等毒株位于同一个分支,亲缘关系最近,属于Ⅱ型弱毒株病毒。生物学毒力测定结果 MDT、IVPI、ICPI分别为92.5、0.2、0,确定分离株为弱毒株。动物回归试验表明分离病毒具有致病性。鸡胚免疫方法研究结果表明接种的最佳病毒效价为22,无鸡胚死亡且孵出的雏鸡可检测到较高的抗体水平。说明可以用新城疫分离毒株来进行鸡胚免疫,有针对性的防控养殖场发生新城疫。     

两种新城疫灭活疫苗免疫原性比较

新城疫作为家禽养殖业危害最大的疫病之一,近些年来常发生免疫失败的现象,究其原因,由于免疫压力的增大和变异株的增多,使疫苗的免疫效果受到极大的挑战,因此选择合适的病毒株制备疫苗对免疫效果具有重要的意义。论文通过测定抗体水平比较新城疫基因Ⅶ型A-Ⅶ株和传统基因Ⅱ型La Sota株油乳剂灭活疫苗对鸡只免疫效价的影响,通过攻毒后的保护、排毒情况及病毒载量的研究,综合比较了2种毒株的免疫原性。通过本试验发现,利用基因Ⅶ型A-Ⅶ株灭活苗与基因Ⅱ型La Sota株灭活苗免疫SPF鸡后,A-Ⅶ株灭活苗所产生的HI抗体效价明显高于La Sota株灭活苗。而通过基因Ⅶ型YND株和标准强毒F48E9株攻毒试验结果显示,2种疫苗均能100%的保护鸡只不死亡,但A-Ⅶ株比La Sota株灭活苗能够更好地抑制强毒在体内的复制和排毒。由此可见,基因Ⅶ型A-Ⅶ株对不同基因型强毒的抵抗能力优于基因Ⅱ型La Sota株,具有更好的免疫原性,通过本试验可为新城疫的防控选择合适的疫苗提供一定的参考。     

新城疫病毒基因型差异性单克隆抗体的制备及鉴定

目前新城疫病毒(NDV)弱毒株的混杂对禽病实验室病原诊断工作造成很大困扰,NDV强弱毒株以及基因型的快速鉴别是亟待解决的重要问题。研究选用一株与疫苗株La Sota存在显著抗原性差异的强毒株PI/CHINA/SD/2012/167制备油乳剂疫苗免疫小鼠制备单克隆抗体。采用间接ELISA检测抗体对该强毒株及La Sota株的反应性,筛选广谱型和强弱毒株差异型的单克隆抗体,最终获得2株存在基因型差异的单克隆抗体。其中,3F10株不与ClassⅠ以及ClassⅡ基因Ⅰ型毒株反应,而与其他毒株都有很好的反应性,而7E11株不仅与ClassⅠ以及ClassⅡ基因Ⅰ型毒株反应性弱,而且与La Sota株和Mukteswar株的反应性也远远低于ClassⅠ基因Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型的强毒株。为了确定两株克隆抗体靶向的病毒蛋白,构建了NDV蛋白真核表达质粒转染DF1细胞,并利用Western blot和间接免疫荧光试验进行检测。结果显示,3F10针对NDV M蛋白,而7E11针对NDV F蛋白。两株单克隆抗体与NDV不同基因型毒株反应的差异性为NDV的鉴别诊断技术研究奠定了基础。