青蒿高产株系001法呢基焦磷酸合酶基因的克隆、原核表达及酶活性测定

法呢基焦磷酸合酶(FPS)是治疗疟疾的特效药物——青蒿素生物合成途径的关键酶。运用RT-PCR方法从青蒿高产株系001中克隆法呢基焦磷酸合酶基因;构建His标签融合蛋白FPS表达载体,进行原核诱导表达、蛋白纯化及酶活性测定的研究。结果表明:克隆的FPS基因和文献已报道的2个青蒿FPS基因编码的氨基酸序列的同源性分别为98.83%和99.42%;原核诱导表达的His标签融合蛋白FPS的表达量高、可溶性好,具有FPS酶活性。     

独行菜法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与原核表达

从独行菜(Lepidium apetalum)中克隆强心苷合成途径的法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因,并在大肠杆菌中表达,为进一步研究独行菜强心苷的合成途径提供参考。分析前期获得的独行菜幼苗转录组数据,选择其中注释为FPS且具有完整开放阅读框的序列,从独行菜叶片c DNA中通过PCR克隆该序列,并进行序列分析。结果表明,克隆得到独行菜FPS基因的cDNA序列,Gen Bank登录号KY366218,命名为La FPS。序列长度为1 332 bp,含有1 161 bp的开放阅读框,推测编码386个氨基酸。La FPS蛋白可能不含跨膜结构,定位于线粒体中,含有聚异戊二烯合成酶结构域。La FPS蛋白氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)FPS1蛋白相似性高达92%,进化树分析结果表明,La FPS与同为十字花科的拟南芥FPS1、遏蓝菜(Noccaea caerulescens)FPS1、高山南芥(Arabis alpina)FPS亲缘关系最近。构建的载体p ET-32a-La FPS可在大肠杆菌中成功诱导表达。表明成功克隆了独行菜FPS基因,并建立了其原核表达体系。     

洋常春藤法呢基焦磷酸合酶基因的克隆与序列分析

以洋常春藤叶片为材料,采用同源RT–PCR方法,克隆获得了洋常春藤法呢基焦磷酸合成酶基因,其c DNA序列大小为1 050 bp,开放阅读框为1 026 bp,推测编码342个氨基酸残基,该序列的核苷酸、氨基酸与五加科植物有同源性;用在线数据软件进行分析,推测该蛋白可能存在于细胞质之中,定位在细胞膜外,FPS蛋白的相对分子质量为39 735.7;该蛋白含有2个天冬氨酸保守结构域,其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主;双子叶植物系统进化树分析结果表明,洋常春藤的FPS与刺五加、人参、三七、西洋参、辽东楤木的FPS亲缘关系最近,这一结果符合传统的分类法规则。     

紫杉二烯合酶基因在灵芝中的表达

【目的】论文旨在研究紫杉二烯合酶基因（ts）在灵芝中的表达情况,为利用灵芝作为生物反应器表达紫杉醇及其中间产物提供科学理论依据。【方法】制备灵芝菌株的原生质体：把培养好的灵芝菌丝用0.6 mol•L-1的甘露醇溶液洗涤两次后,加入1%溶壁酶溶液,30℃水浴酶解3 h,离心去上清液得到纯的灵芝原生质体,用0.6 mol•L-1的甘露醇溶液把原生质体的浓度调整到108个/mL备用;外源基因（ts）的转化：在含有灵芝原生质体的缓冲液各加入含有ts基因和潮霉素抗性基因hph的真核表达载体pgGIgpd-TS和pBgGI-hph 1.0 μg,冰浴30 min;加入0.5 mL PEG buffer,在室温下放置20 min;将离心收集的原生质体涂布在不含有潮霉素的再生平板上,25℃培养5-7 d后,待长出白色菌落后,往平板表层覆盖一层含有潮霉素的PDA半固体培养基,于25℃培养;转化子的鉴定：以灵芝的菌丝基因组DNA和RNA为模板,进行PCR和RT-PCR扩增,鉴定ts基因在灵芝中的表达情况;目标产物的检测：对提取的产物采用不分流进样的方式进行气相质谱联用（GC-MS）检测,进样温度250℃,初始温度100℃,保留1 min,每分钟升高8℃,加热到300℃,保留2 min。【结果】经潮霉素初步筛选后,在含有潮霉素抗性的平板上长出白色的菌落,灵芝原种作为阴性对照的平板上没有长出菌落,说明潮霉素基因被成功转入了灵芝并得到了初步的表达;PCR鉴定结果表明20个拟转化子中有4个转化子同时整合了ts基因和hph基因,两个基因的共转化率为20％;RT-PCR鉴定结果表明,4个灵芝转化子实现了外源ts基因的转录;提取转ts基因灵芝的菌丝产物;经过GC-MS测定分析表明,与原种相比,含有ts基因的灵芝工程菌株有一个明显的差异峰,对该峰进行离子碎片分析表明,该物质为紫衫二烯,说明在含有ts基因的灵芝菌丝体中含有目标产物紫衫二烯。【结论】灵芝作为大型真菌,首次被证实可以通过代谢工程生产合成紫杉醇过程中的中间产物紫杉二烯,为以后紫杉醇的生产提供一个潜在的可能,对今后开展灵芝的分子生物学研究具有重要意义。     

R262K点突变将紫穗槐二烯合酶变为(3R)-(E)-nerolidol合酶

倍半萜合酶家族催化单一底物法尼基焦磷酸形成近300多种链式、单环、双环和三环倍半萜烯、醇,进一步的加工修饰产生种类更加繁多的倍半萜衍生物。详细了解倍半萜合酶产物特异性性决定机制将会为倍半萜合酶的理性设计,定向生成新型化合物打下基础。本研究利用定点突变技术,对紫穗槐二烯合酶RxR基序及相关的D300位点进行了点突变,发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(3R)-(E)-nerolidol,而R262L突变使酶失去活性,R264K突变则对产物比例无影响,显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要,结合R262突变结果,推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。由于RxR基序在倍半萜合酶家族中非常保守,因此其作用是否具有普遍性值得进一步验证。     

橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,命名为TKFPS（GenBank登录号 KJ558350.1）。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 kD,理论等电点（pI）为5.41,平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,TKFPS 蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低。重组子pCAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。     

Ri质粒介导fps基因对烟草的转化及表达

为了探讨外源fps基因表达对发状根合成抗菌物质能力的影响,将含有薄荷(Mentha spicata L.)fps基因的双元表达载体质粒,通过冻融法转化到发根农杆菌菌株Ar1334中,转化菌株与烟草叶圆片共培养诱导发状根产生,共获得18个稳定的发状根无性系,在附加20 mg·L-1卡那霉素的MS培养基上,筛选到4个生长旺盛的无性系.经PCR扩增得到大小为1 kb的目的片段,PCR-Southern检测表明外源fps基因已整合到烟草发状根的基因组中,Northern blot检测证明外源fps基因在转录水平进行了表达;酶活分析显示转基因发状根株系中FPS酶活性明显高于对照,抑菌试验也发现转基因发状根汁液对赤星病菌具有较高水平的抗性,表明外源fps基因在发状根中的表达有利于抗菌物质的合成与积累.     

马尾松GGPPS基因cDNA序列克隆及正义、反义植物表达载体的构建

以马尾松幼苗针叶组织为材料,依据Genbank中已报道的GGPPS基因CDS区序列设计特异引物,经RT-PCR技术克隆得到GGPPS基因cDNA序列。克隆片段经酶解后分别正向、反向插入植物表达载体p-GFP,构建成GGPPS基因正义、反义植物表达载体。采用冻融法将重组质粒导入农杆菌菌株LBA4404,建立植物表达载体系统,为下一步植物转化研究过表达、抑制表达GGPPS基因对萜烯类物质合成的影响建立研究基础。     

烟草4CL与虎杖STS融合基因原核表达载体的构建

植物次生代谢产物白藜芦醇具有抗肿瘤、保护心血管、抗氧化的药理作用。通过分子生物学技术利用带有13个氨基酸的链接序列(linker)将来自烟草的4-香豆酰辅酶A连接酶(4-Coumarate-CoA ligase,4CL)和虎杖的白藜芦醇合酶(Stilbene synthase,STS)的基因连接,构建成融合基因,并转入原核表达载体。为后续的白藜芦醇的代谢工程奠定了基础。但该研究中所构建的融合基因与原基因相比有7个碱基突变,导致4个氨基酸的改变。这些突变是否会影响到融合酶的活性,试验所引入的13个氨基酸的linker对于融合蛋白活性的影响等都还待后续进一步研究。     

一个新杉木纤维素合酶ClCesA基因的克隆与植物表达载体构建

为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的c DNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2 955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,ClCseA基因在杉木的不同器官(根、茎、叶)中均有表达,但在杉木根中的表达含量最高,茎中次之,叶中最低.随后,为后续该基因功能验证提供基础,将ClCesA克隆到含有GFP标签和潮霉素抗性的p GWB506载体,构建植物过表达载体p GWB506-35S-ClCesA-GFP.     

青蒿CYP71AV1和CPR基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建

采用RT-PCR方法从青蒿中克隆紫槐二烯氧化酶基因和细胞色素P450还原酶基因编码区序列,正向插入经改造后获得的双元三价植物高效表达载体p1304*中,构建植物表达载体p1304*-CPR-CYP71AV1,并将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404,获得可直接用于遗传改良青蒿的工程菌p1304*-CPR-CYP71AV1-LBA4404,为利用植物基因工程技术提高青蒿素产量奠定了基础.     

黄花蒿叶片氮磷钾吸收动态及影响因素研究

目的掌握黄花蒿叶片氮磷钾吸收规律。方法全N测定用靛酚蓝比色法,全P采用钒钼黄比色法,全K采用原子吸收分光光度法。结果黄花蒿叶片氮磷钾含量随生育进程呈下降趋势,全生育期氮磷钾含量比为3.5～5.2∶1:3.1～4.6。种源、施肥和种植地点均影响其氮磷钾含量。结论黄花蒿在生长前期需肥量大,施肥以N_(12)P_3K_(12)最适宜叶片对养分的吸收。     

原子吸收光谱法测定青蒿中金属元素含量

使用HNO3-HClO4体系消解样品,采用火焰原子吸收光谱法测定5种不同来源青蒿(Artemisia annua L.)中的Mg、Fe、Mn、Cu和Zn含量.结果表明,青蒿中5种金属元素的含量大小依次为Mg＞Fe＞Zn＞Mn＞Cu,该法加标回收率在98.00％～104.00％,相对标准偏差(n=3)为0.51％～2.86％.该法快速、简便、灵敏、准确,可用于青蒿中金属元素的分析.     

重庆地区青蒿气候适宜性区划研究

以青蒿适宜的气候环境调研与相关资料为基础,研究了青蒿生长发育与青蒿素合成积累过程所依赖的气候条件,确定了青蒿气候区划的指标因子.将重庆地区青蒿气候适宜性划分为最适宜、偏凉适宜、偏暖适宜、偏冷较适宜、偏热较适宜、不适宜6个等级,并应用1∶25万DEM和GIS分析技术进行了区划.结果表明,最适宜区集中于武陵山区的酉阳、秀山与三峡库区的涪陵、万州等地的山地、丘陵地带,南川、丰都、黔江、彭水等地也有零散的最适宜区.这些地区海拔在350～750 m之间,是发展青蒿产业的最佳区域.     

黄花蒿精油对绿豆象成虫体内酶活力的影响

本试验测定了黄花蒿精油对绿豆象成虫体内几种酶活力的影响。试验结果表明:黄花蒿精油对绿豆象成虫体内多种酶均有影响。黄花蒿精油对绿豆象成虫体内乙酰胆碱酯酶活力表现出明显的抑制作用,对谷胱甘肽-S-转移酶表现出明显的诱导作用,对绿豆象成虫体内羧酸酯酶、酸性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶表现出一定的抑制作用。黄花蒿精油进入成虫体内后,同时作用于多靶标,提高了黄花蒿精油对绿豆象成虫的毒杀效果,也将有效延缓害虫产生抗药性。     

不同纬区及不同栽培立地条件对黄花蒿青蒿素含量的影响

本文通过调查对比不同纬区及不同栽培立地条件的黄花蒿中的青蒿素含量来探讨增加青蒿素产量的栽培措施,发现我国种植的黄花蒿中青蒿素含量由南往北逐渐降低,以及采收期和采收部位等栽培措施对青蒿素含量有较明显影响.     

黄花蒿高产优质栽培技术研究进展

黄花蒿是我国的传统中药具有抗疟疾消炎杀菌抗癌等作用,被广泛应用于临床医学,在世界范围内 具有极大的市场。随着市场对青蒿素类药品需求量的日益增多及野生黄花蒿的逐渐匮乏, 如何获得优质高产的黄花 蒿品种,提高人工栽培黄花蒿的生物量及青蒿素含量成为了研究热点对黄花蒿的生物学特征,影响其生物产量和 青蒿素含量的因素,高产优质栽培技术及最新进展等进行综述为黄花蒿的人工种植提供一定的理论依据.     

青蒿非分泌型腺毛特异TPS7基因启动子的克隆及功能分析

研究运用基因组步移法克隆了长度为1 167bp的青蒿启动子proTPS7,经生物信息学分析发现了proTPS7中的多个顺式调控元件。构建启动子与GUS融合载体,稳定转化青蒿并对转基因植株进行GUS染色实验,结果表明该启动子能驱动报告基因在非分泌型腺毛中的特异表达。对转基因青蒿喷洒甲基茉莉酸和脱落酸,3h后GUS基因表达水平有所上调,说明proTPS7能受到上述2种激素的诱导。     

黄花蒿地膜栽培技术初步研究

用黄花蒿"元阳种源"进行露地和地膜栽培试验.结果表明,地膜栽培株高、基茎粗、分枝数、冠幅、单株生物量、青蒿素含量等性状均优于露地栽培,且叶蕾产量差异达显著水平.目前,黄花蒿地膜栽培技术已在云南主要产区曲靖大面积推广.