单核细胞增生性李斯特氏菌快速检测技术研究进展

单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,IM)是主要食源性致病菌之一,可以引起严重的李斯特菌病.日益受到人们的重视,各种快速检测技术也迅速发展.综述了在单增李斯特菌检测时基于常规培养、分子生物学、免疫学和传感器的快速检测技术,并进行了探讨.     

单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失对小鼠毒力和肠道菌群的影响

【目的】探究单核细胞增生性李斯特氏菌Listeria monocytogenes tatD基因缺失对小鼠Mus musculus毒力和肠道菌群的影响,为tatD在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的作用及减毒疫苗研究提供参考。【方法】采用Bliss法将亲本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403sΔtatD)和互补菌株(LM10403sCΔtatD)口服感染小鼠,确定菌株对小鼠的半数致死量(LD50)。LM10403sΔtatD以1.00×105 CFU口服免疫小鼠观察其免疫保护效果。将40只6周龄雌鼠随机平均分为对照即磷酸缓冲盐溶液组(PBS)、LM10403s组、LM10403sΔtatD组和LM10403sCΔtatD组,PBS组小鼠灌胃200μL无菌PBS,实验组分别灌胃200μL含1.00×106 CFU的菌液。灌胃24 h后剖杀各组小鼠,收集肠道内容物,采用Illumina Hiseq测序技术测定各处理小鼠盲肠样品微生物16S rRNA V3～V4区序列,并比较分析其微生物群落结构、多样性和信号通路富集。【结果】LM10403sΔtatD的LD50为8.11×1...     

单核细胞增生李斯特菌毒力因子研究进展

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是一种人兽共患病的病原菌,能引起人、畜的李斯特菌病,Lm的致病性与毒力因子密切相关.对Lm重要的毒力因子(溶血素、磷脂酶、内化素、表面蛋白P104、P60蛋白、ActA蛋白和PrfA蛋白等)进行综述,介绍在致病过程中起主要作用的毒力因子的研究进展.国内外研究表明溶血素是一个多功能的毒力因子,对于Lm的毒力和细胞内的定居是必不可少的;Lm能产生两种磷脂酶C,协助细菌的细胞内复制;内化素介导细菌侵人无吞噬能力的上皮细胞;表面蛋白SP104对于肠道细胞的粘附非常重要;P60蛋白对于Lm的吞噬细胞溶解作用以及对机体的感染过程是一个重要的因素;ActA使得Lm在宿主细胞间能够扩散;PrfA蛋白是李斯特菌唯一毒力凋节蛋白.     

单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及序列分析

构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (L isteria Monocytogenes,L MO)溶血素基因重组质粒。文章采用 PCR方法扩增出 L MO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin,hly)基因 ,将其克隆到 p MD18- T中 ,转化 E.coil TGI。经酶切及 PCR鉴定 ,而后进行测序。 hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6 bp。重组质粒经酶切及 PCR鉴定表明为正确重组子。核苷酸序列鉴定表明 ,其核苷酸序列与国外报道的 L MO F6 789株、L MO F2 36 5株同源性分别为 99.70 %和 99.39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99.82 %和 98.90 %。在国内首次克隆到 L MO hly全基因 ,为研究hly的功能和探讨 hly蛋白作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。     

单核细胞增生李斯特氏菌生物膜形成特性

[目的]研究单增李斯特氏菌生物膜的形成特性。[方法]采用24孔板法培养生物膜,分别采用结晶紫染色法和光学显微镜进行生物膜的定量和定性研究,观察在不同培养时间(8、16、24、32、40、48 h)单增李斯特氏菌生物膜的形成状况。[结果]随着培养时间的增加,单增李斯特氏菌生物膜生物量逐渐增加,生物膜经历了黏附、微菌落形成、大菌落形成到成熟的全部过程。[结论]试验结果为单增李斯特氏菌生物膜相关研究提供了理论依据。     

单核细胞增生性李斯特菌iap基因的原核表达

该研究利用自行设计的引物通过PCR方法扩增出单核细胞增生性李斯特菌 Listeria monocytogenes C5305 株的iap基因,在iap基因的5'端和3'端分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ 2 个酶切位点并将其克隆到pET-28a表达载体上,经PCR鉴定、酶切鉴定和核苷酸序列测定后获得重组质粒 pET-28a-iap,将该重组质粒转化人大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS,经1 mmol/LIPTG诱导4～6 h后,通过SDS-PAGE及Western-blotting鉴定,证明该基因得到表达,表达产物相对分子质量约为60 000,以可溶形式存在.     

单核增生李斯特氏菌的分布研究

对采自人和动物粪便、冷链食品、猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鱼肉等640份样品进行李斯氏菌的分离与鉴定,研究了李斯特氏菌的分布状况,检出单核增生李斯特氏菌1株,英诺克李斯特氏菌7株,威尔斯李斯特氏菌1株,格氏李斯特氏菌34株,默氏李斯特氏菌6株;单核增生李斯特氏菌的检出率为0.16%,李斯特氏菌的总检出率为7.66%。     

荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。     

鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌的分离与鉴定

对从长春地区某一肉鸡屠宰加工厂扦取的１５２个东鸡肉样品进行的单核细胞增生李斯特氏菌分析,对分离菌株用ＡＰＩ Ｌｉｓｔｅｒｉａ试剂盒及其他方法进行了鉴定。经检验,１５２个样品中有１６个样品（１０．５％）为单核细胞增生李斯特氏菌阳性,另有８７个（５７．２％）为Ｌ．ｉｎｏｃｕａ,Ｌ．ｗｅｌｓｃｈｉｍｅｒｉ和Ｌ．ｇｒａｙ阳性。为了比较ＯＸＡ和ＰＡＬＣＡＭ这２种选择培养基的单核细胞增生李斯特氏菌的分离效果,     

洛阳地区鸡肉中单增李斯特菌毒力基因的分布研究

为分析鸡肉中单增李斯特菌毒力基因的分布特征,从洛阳地区市售鸡肉中分离18株单增李斯特菌,血清凝集试验确定其血清型,然后采用PCR方法对inl A、inl B、virR、dlt A、dlt B、dlt C、dlt D及mpr F等8个毒力基因进行检测。结果显示,18株分离株血清型均为1/2型,且有9株具有全部毒力基因,其中inl B、dlt A、dlt B基因全部呈阳性,inl A、virR、dlt C、dlt D、mpr F存在缺失现象,其检测率分别为88.9%(16/18)、94.4%(17/18)、83.3%(15/18)、88.9%(16/18)、83.3%(15/18)。毒力基因缺失与血清型相关性分析结果显示,不同血清型缺失基因呈多样性。表明这8个毒力基因在市售鸡肉的单增李斯特菌中普遍分布。     

单核增生性李斯特氏菌mpl和plcB基因分布

为了研究mpl和plcB基因在单核细胞增生李斯特菌中的分布状况,为单核细胞增生李斯特菌的防治及追溯提供依据。本试验以分离自生肉、熟肉制品、冷冻食品、水产品、蔬菜等6类不同来源共105株单核细胞增生李斯特菌株作为研究对象,利用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌mpl、plcB基因的分布进行检测。结果表明:所有菌株均有这2个基因中的一个或全部,总检出率为100%。其中,mpl基因总检出率为82.9%,plcB基因的总检出率为98.1%。食品来源不同,单核细胞增生李斯特菌mpl、plcB基因的检出率不同,且同一来源的菌株其mpl和plcB的检出率也不同,表明不同来源以及不同的毒力基因在单核细胞增生李斯特菌中的分布存在差异。     

氧化还原失衡对单增李斯特菌毒力基因转录水平的影响

保持氧化还原平衡对生物体维持其正常生理活动具有重要作用。单增李斯特菌是可以自身合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)的革兰氏阳性菌,GSH可影响该菌毒力基因的转录。为了研究氧化还原平衡对于单增李斯特菌毒力基因转录水平的影响,利用氧化剂H_2O_2和还原剂GSH分别对单增李斯特菌进行氧化和还原应激,qRT-PCR检测毒力基因hly、actA和plcB的转录水平变化,结果表明,22 mmol/L H_2O_2和10 mmol/L低浓度GSH均能诱导毒力基因转录水平的显著上调,而22 mmol/L高浓度GSH则抑制毒力基因的转录,表明在单增李斯特菌的氧化还原平衡调节能力范围之内,有效打破其氧化还原平衡,无论是氧化应激,还是还原应激,都可以促进其毒力基因的转录。     

环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

[目的]采用环介导等温扩增技术,快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌。[方法]以单核细胞增生性李斯特氏菌（CMCC54001）的hlyA基因作为靶基因,设计引物,观察检测结果。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测单核细胞增生性李斯特氏菌的最适反应条件。采用该方法检测单核细胞增生性李斯特氏菌的灵敏度为4.2CFU/ml。[结论]该研究建立了环介导等温扩增技术单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法。     

绵羊产单核细胞李斯特菌的分离及鉴定

采用生化反应、溶血试验、致病力试验等常规方法对从疑似产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)患病羊脑组织分离的病原作了初步鉴定.通过PCR扩增hlyA基因部分保守序列,测序证实其与已报道的核苷酸序列的同源性达到100%,从而确诊该菌为产单核细胞李斯特菌.     

貉源李氏杆菌的分离与鉴定

采用常规细菌分离方法从病死貉的脑、肝脏、肾脏分离培养得到6株菌株,对分离菌株进行形态特征、培养特性观察及生化特性鉴定,结果确诊分离菌株为李氏杆菌。以该菌株接种家兔,接种后第7d开始出现死亡,并从家兔的肝脏、脾脏检测出与接种细菌一致的菌株,证实了李氏杆菌对家兔亦有一定的致病性。药敏试验结果表明,该分离菌对卡那霉素、头孢噻肟钠、万古霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素敏感;必要时应筛选出具有协同作用和累加作用的抗生素,以便临床上联合应用抗生素,提高治疗李氏杆菌病的疗效。     

银川市市售食品中单增李斯特菌污染状况分析研究

[目的]了解银川市市售食品中单增李斯特菌的污染状况及其血清型和耐药性特点。[方法]以宁夏银川市售各类生鲜食品为原料,菌株的分离鉴定按照GB4789．30—2010《单核细胞增生李斯特氏菌检验》和国家食源性疾病监测网监测方案进行;血清型检验按照血清凝集试验进行;药物敏感性试验按照K—B纸片扩散法进行。[结果]720份食品中检出单增李斯特菌45株,总检出率为6．25％,分属5个血清型,主要为1／2a型。污染率最高的是生鸡肉（8．33％）。耐药性研究表明单增李斯特菌对多粘菌素的耐受最严重,耐药率为77．78％,此外还耐受头孢噻肟、四环素、呋喃妥因、青霉素、红霉素和头孢噻吩,且出现多重耐药。[结论]银川市食品中存在不同程度的单增李斯特菌污染,生肉中单增李斯特菌检出率较高,应加强监测工作。同时存在致病性较强的血清型,呈多重耐药性趋势。