甜味蛋白Brazzein基因合成及其在酵母中表达的初步研究

采用pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌。按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因,共设计4对引物,采用SOE-PCR法合成Brazzein基因,构建克隆载体pUC57-Bra与酵母表达载体pGAPZαA-Bra。将重组质粒线性化,电转导入Pichia.pastoris SMD1168中,用高浓度的Zeocin筛选高拷贝转化子。将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,进行SDS-PAGE分析。成功构建了分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌,SDS-PAGE表明,目标蛋白的相对分子量与理论值一致,诱导72h后的目的蛋白表达量达0.12g/L。     

马铃薯质体表达载体构建及GFP基因在块茎中的瞬时表达

利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点, 根据烟草质体基因组全序列设计合成引物, PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因片段。将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段, 构建成包含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的马铃薯质体定点转化载体pBMLSIA-GFP, 酶切鉴定表明, 所构建载体符合预期设计。采用该载体对马铃薯块茎进行基因枪法转化, 结果表明, GFP基因可在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下在马铃薯块茎中瞬时高量表达, 经基因枪轰击后马铃薯块茎在紫外投射仪下产生很强的绿色荧光, 在距离为6 cm, 压力1 100 psi轰击2枪的条件下产生的绿色荧光最强。马铃薯块茎可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析表明, GFP蛋白表达量约占总可溶性蛋白的15.4%~30.2%, 均达到了较高的表达水平。该载体对后期马铃薯质体转化体系的建立和其他功能基因导入马铃薯质体进行性状改良具有重要应用价值。     

过量表达星星草(Puccinellia tenuiflora)液泡型H~+-ATP酶c亚基基因提高转基因酵母的耐盐性

植物液泡型H+-ATP酶(V-ATPase)在次级转运与应对多种逆境胁迫中具有重要作用。本研究克隆并解析了能够生长在盐碱地上的野生星星草V-ATPase c亚基基因(Put VHA-c)的功能。本研究利用荧光蛋白(GFP)标记结合内涵体染色的方法研究了Put VHA-c蛋白在酵母细胞中的定位,并利用转基因酵母分析了Put VHA-c基因在盐胁迫中的作用。共定位实验显示Put VHA-c-GFP融合蛋白主要定位在酵母细胞的内涵体上。Northern杂交和实时定量PCR显示在星星草悬浮细胞中Put VHA-c基因的表达能够被盐胁迫所诱导。研究结果结合过表达Put VHA-c的转基因酵母具有更高的耐盐性的发现,说明Put VHA-c基因参与着盐胁迫的应答。     

玉米叶绿体表达载体构建及绿色荧光蛋白基因瞬时表达检测

Tps1是生物保护物质海藻糖的关键合酶基因.构建含Tps1的玉米叶绿体表达载体,首定从玉米叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段;然后将编码酵母海藻糖合酶基因Tps1表达盒(Prrn-Tps1-TpsbA-ter)、草丁膦抗性基因Bar表达盒(RpsbApro-Bar-RpsbAter)、卡那霉素抗性基因Npt Ⅱ和绿色荧光蛋白基因Gfp构建的融和基因表达盒(Prrn-Npt Ⅱ/Gfp-RrbcLter)一起克隆到定点整合同源片段之间,构建了玉米叶绿体的稳定表达载体mTKGB.通过基因枪轰击法将mTKGB转化到玉米幼嫩叶片中,培养2 d后,在激光扫描共聚焦显微镜下脱测到玉米一些细胞的叶绿体中有很强的GFP绿色荧光,结果表明构建的载体可在玉米叶绿体中表达.     

DREB1C-GFP融合基因植物表达载体的构建

为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR）方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1-GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与设计相符。     

马铃薯损伤诱导型启动子Wun1基因的克隆及其GFP表达活性

通过聚合酶链式反应(PCR),以马铃薯基因组DNA为模板,根据已报道Wun1序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Wun1基因片段,通过序列分析与文献报道的碱基序列有96.86%的同源性,该基因已登录到GenBank(No.AY803296)。以pBIPG(携带GFP基因)的质粒DNA为模板,通过PCR技术亚克隆到了源自水母(Aequorea)大小为756bp的绿色荧光蛋白(GFP)基因,与已知序列同源率为100%。利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIWG(Wun1-GFP)两个植物表达载体,采用基因枪法进行对洋葱表皮细胞的遗传转化,检测Wun1启动子在受体细胞中调控基因表达的活性,结果表明克隆到的Wun1启动子活性强于组成型表达的35S启动子,GFP瞬时表达的分析方法也让我们有效的筛选到用于进行马铃薯抗病育种的调控元件。     

CHX-GFP融合基因的构建及在胡萝卜愈伤组织中瞬时表达

为构建CHX-GFP融合基因并将其在胡萝卜愈伤组织中瞬时表达。采用融合PCR方法,将属于CAP2家族的Na+/H+反向转运蛋白基因CHX和GFP基因相融合,利用中间载体,采用DNA重组技术将CHX-GFP融合基因插入到p1301植物表达载体中,采用冻融法将重组质粒导入到农杆菌中,遗传转化时所用侵染液为1/2MS+AS 100μmol/L,共培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+琼脂6 g/L+蔗糖30 g/L+葡萄糖10 g/L+AS 50μmol/L,共培养时间为4 d。成功构建了p1301-35S-CHX-GFP-Nos植物表达载体,CHX-GFP融合基因在胡萝卜愈伤组织中得到瞬时表达,表达效率为75%。采用融合PCR获得CHX-GFP融合基因的方法比较简单,无须知道DNA序列的酶切位点,省时省力,CHX-GFP融合基因及其表达载体的成功构建将为进一步探查CHX亚细胞定位及CHX基因的功能奠定了基础。     

去甲斑蝥素杀虫活性增效研究

去甲斑蝥素具有明显的杀虫活性,研究其杀虫增效活性有利于开发利用该物质。通过去甲斑蝥素与毒死蜱混配以及5%去甲斑蝥素微乳剂的研制,采用浸叶法研究2种单剂、混剂和微乳剂对菜蛾的毒力作用。结果表明：48 h后,去甲斑蝥素与毒死蜱的LC50值分别为93.97、528.69 mg/L,去甲斑蝥素的击倒力较高,去甲斑蝥素与毒死蜱分别以1:5、1:2.5、1:1.25混配后,48 h的共毒系数为186.75、181.72、166.49,均表现为增效作用。在微乳剂中加入2%、5%的有机硅后,毒力分别提高至原来的1.32、1.68倍。去甲斑蝥素与毒死蜱混配,48 h后呈现出增效作用,将去甲斑蝥素加工成微乳剂后,对菜蛾的毒力作用明显增强,向微乳剂中添加一定量的有机硅后,对菜蛾的毒力明显增强。     

棉花(Gossypium hirsutum)ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及鉴定

ROP是高等植物里一类分布广泛的信号小G蛋白,在植物生长、发育、抗逆、抗病和激素信号转导过程中起重要调控作用。本研究用PCR体外扩增技术获得棉花GhROP1基因片段,将目的基因与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组,构建诱饵质粒pGBKT7-GhROP1,并成功的转入到Y187酵母菌通过缺陷性培养基培养进行毒性和自激活检测。结果表明,成功克隆棉花GhROP1基因,该基因开放阅读框共有591 bp。双杂交诱饵表达载体pGBKT7-GhROP1构建成功,并成功转化酵母菌Y187;结果显示含表达载体的酵母菌Y187在SD/-Trp平板上长势良好,说明表达蛋白对酵母菌无毒害作用。在SD/-Leu,SD/-Trp-Leu,SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上则没有生长,说明转化pGBKT7-GhROP1质粒后的Y187酵母菌无自激活发生。本研究结果为下一步利用酵母杂交系统筛选GhROP1蛋白相互作用的蛋白提供理论参考。     

BYDV-GAV外壳蛋白和复制酶基因酵母双杂诱饵载体的构建及表达

在植物病毒侵染过程中,病毒蛋白能够与寄主蛋白发生相互作用以利于病毒的复制、积累和扩散。酵母双杂交系统是体外研究蛋白相互作用的有利工具,其在致病机制研究中得到广泛的利用。本研究利用大麦黄矮病毒(BYDV)外壳蛋白(CP)和依赖RNA的复制酶(RdRp)基因的全长序列,构建了这2个基因的酵母双杂诱饵载体pG-BKT7-CP和pGBKT7-RdRp,并转化酵母进行表达分析。含有pGBKT7-CP和pGBKT7-RdRp诱饵载体的酵母,在SD/-Trp固体培养基和SD/-Trp/Kan液体培养基中都能正常生长,但在SD/-Ade/-Trp/X-Gal和SD/-His/-Trp/X-Gal培养基上不能生长。结果表明,这2个载体表达的融合蛋白对酵母没有毒害作用,且自身没有激活性,可作为酵母双杂系统的诱饵载体,用来分析与外壳蛋白和复制酶相互作用的蛋白。     

转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因小麦的耐盐耐旱性

采用室内模拟盐、旱胁迫，结合田间实际测定的方法，对基因枪法获得的转BADH基因小麦多个株系的不同世代材料进行了耐盐、耐旱性鉴定。结果表明，在旱、盐胁迫条件下，转BADH基因小麦在种子萌发、幼苗生长、根系发育以及质膜保护等方面均比受体品种（对照）具有明显的优势；在田间生长条件下的转基因株系，其叶片蒸腾强度比对照明显降低，而离体叶片失水速率与对照没有明显差别。     

水稻OsAPX1基因在烟草中的表达及其抗盐性研究

本研究采用RT-PCR方法克隆得到水稻细胞质抗坏血酸过氧化物酶(OsAPX1)基因全长cDNA(基因登录号:D45423);将该基因构建二元植物表达载体pBI121-OsAPX1;用农杆菌EHA105侵染介导烟草叶盘转化法转基因,获得转基因植株,PCR鉴定遗传转化的烟草植株成功地整合了水稻OsAPX1基因;Northern blot鉴定结果表明转基因T1代植株Ta在mRNA转录水平上表达;对Ta株系进行Kana抗性鉴定,表明转基因T2代株系有抗性;对T2代株系做NaCl、NaHCO3、Na2CO3抗盐性鉴定,结果表明与对照相比表现出转基因植株抗(耐)性提高;取T2代植株的叶片在不同浓度H2O2处理下,抗H2O2毒害的能力显著强于对照,转基因植物的抗性有所提高,有望在抗盐碱性育种上应用.     

苜蓿耐盐基因分子标记的筛选

以耐盐苜蓿×敏盐苜蓿组合的F2群体为试验材料,利用改良BSA法筛选与苜蓿耐盐基因紧密连锁的分子标记.在对26组520条RAPD随机引物筛选中,共有66条引物为DNA多态性引物,选出一个与苜蓿耐盐基因相连锁的分子遗传标记.通过F2代群体的遗传分析,观测到分子标记与耐盐性等位基因之间发生重组,但重组值较小,在A8×D2杂交组合中,重组率为2.27%;在A5×D1杂交组合中,重组率为4.03%.这些结果表明,这一显性标记与苜蓿的耐盐基因座位连锁程度较为紧密.用国外登记的耐盐苜蓿种质及相对敏盐种质单株对获得的耐盐标记进行验证,85%耐盐种质材料AZ-90NDC-ST的单株DNA都扩增出1个约1 400bp的DNA片段;75%敏盐种质材料AZ-88NDC的单株DNA未能扩增出此片段.     

水稻耐盐基因SKC1等位变异突变体耐盐性评价

SKC1基因是已经克隆的水稻耐盐主效基因,位于水稻1号染色体。为了在水稻育种中高效利用SKC1耐盐基因,前期研究利用TILLING技术检测宁夏水稻主栽品种宁粳28号EMS诱变群体,得到了SKC1基因的SNP突变体。本研究通过芽期、苗期、孕穗期、全生育期耐盐性鉴定,对16份农艺性状优良的水稻耐盐基因SKC1等位变异突变体的耐盐性进行了全面评价,结果表明:耐盐性强的突变材料有:18NY-10、18NY-12、18NY-14,耐盐性较强的突变材料有:18NY-2、18NY-4、18NY-5、18NY-6、18NY-7、18NY-8、18NY-13、18NY-16。结果可为宁夏水稻耐盐育种提供种质资源。     

苜蓿耐盐基因分子标记的筛选及鉴定

以耐盐苜蓿×敏盐苜蓿组合的F2群体为试验材料,利用改良BSA法筛选与苜蓿耐盐基因紧密连锁的分子标记。在对26组520条RAPD随机引物筛选中,共有66条引物为DNA多态性引物,选出一个与苜蓿耐盐基因相连锁的分子遗传标记。通过F2代群体的遗传分析,观测到分子标记与耐盐性等位基因之间发生重组,但重组值较小,在A8×D2杂交组合     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力

Hrip1是从极细链格孢(Alternaria tenuissima)代谢物中分离的一种蛋白激发子。将蛋白激发子基因Hrip1转化到拟南芥,对5个T₁代转基因拟南芥株系进行分子检测, 证明Hrip1基因能够在拟南芥中转录和表达。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强, 75 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇渗透胁迫2 d, 转基因植株种子平均相对发芽率为32.1%和77.9%, 分别比野生型的增加3.72倍和5.61倍; 150 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇处理拟南芥幼苗7 d后, 转基因植株平均相对根长为81.79%和93.25%, 分别是野生型的1.53倍和1.34倍。3周龄的转基因植株在250 mmol L⁻¹ NaCl条件下胁迫20 d, 平均存活率为67%, 显著高于野生型(42%)(P<0.05); 干旱胁迫25 d后, 复水5 d转基因植株平均存活率为72%, 而野生型仅为44%。检测结果显示转基因植株叶片的抗氧化酶活性明显高于野生型, 用200 mmol L⁻¹ NaCl和200 mmol L⁻¹甘露醇处理24 h后, POD活性分别比野生型植株提高1.56倍和1.85倍, CAT活性分别比野生型植株提高1.64和1.86倍。说明蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中的表达能够改善和提高植株的耐盐抗旱能力。     

青花菜BoPGIP1基因的原核表达及其重组大肠杆菌的抗逆性分析

为进一步验证青花菜Bo PGIPl基因的功能,通过RT-PCR方法克隆得到青花菜Bo PGIP1基因完整的编码区序列,将其克隆到原核表达载体p ET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达Bo PGIP1基因的重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1),重组菌经IPTG诱导表达以及SDS-PAGE电泳检测,结果表明,在37 k Da处有一条特异表达的蛋白质条带,与预期的目的产物大小一致;同时对重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1)的抗逆性进行分析,结果表明,BL21(p ET28a-Bo PGIP1)对Na Cl(0.4 mol/L)、Na HCO3(0.2 mol/L)和PEG6000(20%)的抗性明显高于对照菌株BL21(p ET28a),该抗性的证明为Bo PGIP1基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了理论依据。     

盐胁迫对苜蓿种子发芽性状的影响及其耐盐性评价

为了阐明盐胁迫条件下紫花苜蓿种子的发芽性状表现和种子萌发期耐盐性能强弱,同时为改良盐碱化土壤提供更加耐盐碱的植物品种,提高盐碱化土地资源利用率,本试验以5个苜蓿(Medicago sativa)品种为材料,采用不同浓度NaCl处理(0、0.4%、0.8%、1.2%),研究了不同盐浓度对苜蓿种子发芽率、发芽势、苗高、根长的影响。结果表明,盐胁迫对苜蓿种子发芽性状均有较大影响,随着NaCl浓度的提高,苜蓿种子发芽率和发芽势降低,苗长和根长明显缩短,而且,高质量浓度盐胁迫对苜蓿种子发芽性状的影响尤为显著。不同苜蓿品种在不同盐浓度间的差异显著;品种间各指标的表现不尽相同,发芽势与发芽率指标在品种间的差异显著,苗高和幼根长指标在品种间的差异不显著。综合单项指标耐盐系数和品种综合耐盐指数来看,5个苜蓿品种的耐盐性能强弱顺序为‘Magnum salt’>‘中苜1号’>‘维多利亚’>‘巨人201T’>‘皇冠’。