蓖麻GA20-氧化酶基因表达分析

为研究GA20氧化酶基因在蓖麻中的表达情况,以具有典型代表的4种高秆和4种矮秆蓖麻品种为材料,采用实时定量PCR和荧光定量PCR技术,对GA20氧化酶基因在蓖麻的不同器官及器官发育的不同阶段的表达特异性进行分析。结果表明,蓖麻的矮化不是由GA20氧化酶基因的突变所引起;GA20氧化酶基因在种子和嫩叶中的表达量最高,在成熟叶中可大量表达,在茎中可微量表达,在根中可痕量进行表达;同一生长时期,高秆品种的GA20氧化酶基因表达量明显高于矮秆品种,不同生长时期高秆品种GA20氧化酶基因的表达量呈现由高到低再升高的变化趋势,而矮秆蓖麻GA20氧化酶基因的表达量始终处于相对较低水平。该研究结果为进一步阐明蓖麻GA20氧化酶基因的功能特征及揭示其参与调控植物生长的分子机制提供了参考。     

拟南芥GA20氧化酶家族的生物信息学分析

采用生物信息学的方法对拟南芥中多个GA20氧化酶(GA20ox)氨基酸序列的理化性质、亚细胞定位、进化关系、基序和磷酸化修饰位点进行了预测和分析.结果表明,拟南芥中的GA20ox可被划分为2个亚类,1个亚类被预测定位于细胞质,另1个亚类被预测定位于叶绿体.     

小麦TaGA20ox2基因的克隆及分析

 【目的】克隆小麦中的GA20-氧化酶基因并进行遗传定位,为深入研究小麦中的GA20-氧化酶基因作用机理奠定基础,同时为改良小麦的重要农艺性状提供理论依据。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,利用中国春缺失体以及国际作图群体对该基因进行遗传定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaGA20ox2的gDNA与cDNA序列,利用中国春缺失体材料将TaGA20ox2定位于3A、3B、3D染色体上,序列分析表明分别位于3A、3B、3D染色体上的TaGA20ox2-A1、TaGA20ox2-B1和TaGA20ox2-D1与水稻GA20ox2为直向同源基因,具有GA20ox2家族保守结构域;利用国际作图群体W7984×Opata85将位于3D上的基因TaGA20ox2-3定位于xfba330与xgwm664标记之间。【结论】分离获得小麦中分布于第三同源群的GA20ox2;分子标记结果结合QTL作图信息可以初步推测TaGA20ox2-3在小麦中可能是控制株高的基因。     

GA2-oxidase氧化酶基因的研究进展

GA2-oxidase氧化酶(GA2ox)是影响赤霉素合成和代谢的关键酶之一,其可以将具有生物活性的赤霉素或前体分解成没有生物活性的物质,在植物的生长发育中起着重要的作用。目前已经在拟南芥、杨树、水稻和葡萄等多种植物中克隆表达,其功能在不同物种之间也存在着差异。本研究主要从GA2ox基因的表达模式和基因功能进行阐述,重点阐述了GA2ox基因的时空表达情况,环境和激素对GA2ox基因的表达影响;GA2ox基因对植物的株高、花、果实和种子性状的改变,及与抗性的相互作用,更好地为了解GA2ox基因的作用机制提供参考。     

魔芋多酚氧化酶基因保守区的克隆及序列分析

根据植物多酚氧化酶基因保守区域设计简并引物,采用同源克隆的方法,从花魔芋幼叶中首次克隆得到魔 芋PPO 基因的部分gDNA和cDNA片段.该gDNA和cDNA片段长度均为762bp,编码254个氨基酸残基.生物 信息学分析表明具有酪氨酸酶家族的特征,具有保守的CuA和CuB结合区.系统进化树表明:花魔芋PPO 蛋白与 禾本科植物(大麦、小麦、玉米)最先聚为一类,亲缘关系最近.     

酸橙ACC氧化酶基因片段克隆及序列分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶是植物乙烯合成的1个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据已报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,以酸橙叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到1个834 bp的基因片段。克隆了酸橙1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶基因cDNA片段,将片段序列在NCB I网站上进行同源性搜索,显示的皆为不同植物的ACC氧化酶基因,因而认为所克隆的片段就是酸橙ACC氧化酶基因;并运用DNAStar5.0软件进行序列分析,推导的氨基酸序列为278个残基;具有所有植物ACC氧化酶基因共有的保守区域;与多种植物的ACC氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在72%和70%以上。     

高等植物赤霉素20-氧化酶基因的克隆、表达及其调控技术的研究进展

揭示赤霉素20-氧化酶基因的分子特征,通过转基因技术调控植物体内活性赤霉素的含量,可为改良品种提供新的思路。从赤霉素20-氧化酶基因的克隆、表达调控及其在植物基因工程中的应用等方面进行了综述。     

PttGA20-氧化酶基因dsRNA抑止载体的构建

[目的]通过基因工程手段抑止赤霉素调控基因PttGA20-氧化酶基因的表达,从而抑制植物高生长和节间伸长,达到培育矮化植株的目的。[方法]依据RNAi原理,设计引物扩增正义及反义PttGA20ox片段插入pBI121载体CaMV35S启动子下游区域,并在正义和反义片段间隔区插入茎环结构GUS基因片段,将npⅡt标记基因替换为抗除草剂基因bar,构建dsRNA抑止载体。[结果]所构建的抑止载体经经不同内切酶酶切鉴定后均可释放出与目的条带大小相同片段,表明已成功构建PttGA20-氧化酶基因dsRNA抑止载体。[结论]该研究为培育矮化植株提供了新的途径。     

碱蓬多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶,是碱蓬甜菜红素合成的第一关键酶.以盘锦红海滩碱蓬(盐地碱蓬)为研究材料,采用同源克隆法,根据植物中已克隆出的PPO序列进行引物设计,利用RT-PCR和RACE技术,从碱蓬中克隆出的PPO基因cDNA全长为1830bp,编码609个氨基酸.序列分析表明,与其他植物PPO核苷酸序列的相似性为69％～87％,氨基酸的相似性为49％～62％.碱蓬多酚氧化酶基因的成功克隆,为碱蓬甜菜红素的研究和利用打下了坚实的理论基础.     

板栗多酚氧化酶性质的研究

为解决板栗加工褐变的问题,采用分光光度法对板栗果肉中多酚氧化酶的性质进行了研究,分别求出该酶的适宜温度为40～60 C,最适pH值为4.0和7.0,Vmax=0.93吸光度/min,Km=76.15mmol/L.并探讨了该酶的热稳定性以及抑制剂氯化钠、柠檬酸、四硼酸钠、亚硫酸氢钠和抗坏血酸对酶活力的影响.     

‘南通小方柿’GA2ox基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】从地方矮化品种‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.cv.Nantongxiaofangshi)中分离赤霉素合成关键酶基因GA2ox,并进行亚细胞定位及表达分析,为进一步探索其矮生性状形成机理及选育新型矮生品种奠定基础。【方法】以‘南通小方柿’幼嫩叶片为材料,通过改良的CTAB法提取总RNA,利用简并引物克隆GA2ox家族中2个基因的片段,采用3′和5′RACE方法得到基因的全长c DNA序列,分别命名为Dk GA2ox1和Dk GA2ox2。通过生物信息学方法分析结构特征,利用GFP进行亚细胞定位,实时荧光定量RT-PCR技术研究其在发芽期、展叶期、枯顶期、开花期、生理落果期、果实着色期、果实成熟期中的表达特性。【结果】生物信息学分析Dk GA2ox1和Dk GA2ox2全长c DNA序列分别为1 318 bp和1 267 bp,分别含有198 bp和61 bp的5′非翻译区及97 bp和172 bp的3′非翻译区。编码332个和334个氨基酸,与毛白杨(JX102472.1)、夹竹桃(AY594292.1)、烟草(AB125232.1)、矮牵牛(GU059939.1)、苹果(FJ571521.1)、梨(JF441168.1)、葡萄(JQ608472.1)的相似度达73%—77%。含有保守20G-Fe(Ⅱ)-Oxy蛋白结构域,高度保守的2-酮戊二酸结合位点(Dk GA2ox1:Arg-272、Ser-274;Dk GA2ox2:Arg-271、Ser-273)和Fe2+结合位点(Dk GA2ox1:His-205、Asp-207、His-262;Dk GA2ox2:His-204、Asp-206、His-261),有赤霉素2-氧化酶蛋白家族共同的结构特点。Dk GA2ox1和Dk GA2ox2编码蛋白分子量分别为36 596.1 Da和37 544.2 Da,均为稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构域,无明显疏水区,属于C19-GAoxs。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,Dk GA2ox1编码蛋白定位于细胞核和细胞质中。Dk GA2ox1和Dk GA2ox2在开花期表达最丰富,并在7个典型物候期中均高于乔化品种‘大方柿’。【结论】南通小方柿中赤霉素2-氧化酶基因的表达与其矮生性状有关。     

欧文氏菌T85—166果胶酶基因克隆与序列分析

根据果胶酶Pel基因在欧文氏菌基因组上的分布特点,通过合理设计引物,从欧文氏菌株T85-166克隆出3个果胶酶Pel基因(Pel-1、Pel-2和Pel-3),它们分别编码372、373和374个氨基酸.序列分析表明,Pel-1前105及后100个氨基酸序列与Pel-2完全相同,但与Pel-3有较大差异,而中间170个左右的氨基酸序列与Pel-3则高度相似.初步构建了3个Pel基因的工程菌.     

F4菌毛FaeG基因的克隆与序列分析

[目的]克隆F4菌毛FaeG基因,并对其进行序列分析。[方法]利用PCR方法从6株标准F4菌株中扩增FaeG基因片段,测序后用DNAStar软件进行分析和拼接,并与已发表的F4菌毛基因序列进行分析和比较,绘制基因进化树,比较它们之间的同源性和进化关系。[结果]试验成功扩增出FaeG基因片段;所扩增的6株已知血清变异型F4大肠杆菌与标准F4菌株同属于各自基因型,且F4ab与F4ac间的进化关系比与F4ad菌株间的近。[结论]通过该研究可推测F4菌株3个血清变异型的检测不仅可用单因子血清,而且可从DNA水平上进行检测。     

猪围脂滴蛋白基因cDNA部分片段的克隆及序列分析

采用比较基因组学和简并PCR方法,根据人、小鼠和大鼠等物种PLIN基因的序列,设计简并引物,克隆了猪PLIN基因包括起始密码子的部分cDNA序列,大小为978 bp(GenBank登录号为EU416277)。该序列与人和小鼠相应序列的相似性分别为87%和83%,编码325个氨基酸,具有1个PAT-1结构域、2个蛋白激酶A位点和1个富含谷氨酸的酸性基序,预测的氨基酸序列与人、小鼠、牛和绵羊相应区域序列的相似性分别为87%,82%,86%,86%。该基因的克隆为进一步研究其功能奠定了基础。     

油菜脂肪酸延长酶基因fae1片段的克隆与SNP分析

 脂肪酸延长酶基因fae1是调控油菜芥酸合成的关键基因。本研究利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物，通过多聚酶链式反应（PCR）从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜（包括2个人工合成种）的12个不同品种中扩增出长1 007bp的fae1基因片段。PCR产物经与克隆载体pGEM-T vector连接和序列测定，获得12个品种的fae1基因片段的DNA 序列。对来自12个不同品种的fae1基因序列进行比较分析表明：fae1基因具有高度序列保守性，扩增长度均为1 007 bp，核苷酸序列相似度达98%以上，氨基酸序列的保守性更高。在1007 bp的区间内共发现23个SNP(single nucleotide polymorphism)位点，其中有11个单核苷酸变异导致了编码氨基酸的改变。人工甘蓝型油菜和天然甘蓝型油菜的fae1基因片段未发现明显差异。发现了高芥酸品种与低芥酸品种的fae1基因、以及A基因组与C基因组的fae1基因特有SNP位点。     

猪伪狂犬病毒湖北株gE基因的克隆与序列分析

[目的]通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因克隆和测序,分析其遗传变化规律。[方法]参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对PRV湖北株gE基因进行PCR扩增和序列分析,PCR产物克隆到pMD 18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株进行同源性分析和比较。[结果]与标准参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,进化树分析表明,PRVHBXS2014株与河南焦作株EU561349-China同属于一个分支,亲缘关系较近,但存在个别位点的基因突变。[结论]为有效防控该病提供参考。     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

Cloning and Sequence of Glycoprotein H Gene of Duck Plague Virus

The glycoprotein H （gH） gene homologue of duck plague virus （DPV） was cloned by degenerate polymerase chain reaction （PCR） and sequenced. It was located immediately downstream from the thymidine kinase gene （TK）. In addition, the 3＇-end of the gene homologue to herpesvirus UL21 was located downstream from the gH gene. DPV gH gene open reading frame （ORF） was 2 505 bp in length and its primary translation product was a polypeptide of 834 amino acids long. It possessed several characteristics of membrane glycoproteins, including an N-terminal hydrophobic signal sequence, an external domain containing eight putative N-linked glycosylation sites, a C-terminal transmembrane domain, and a charged cytoplasmic tail. Comparison with other herpesvirus revealed identities of 20.2, 25.1, 23.0, 23.0, 26.5 and 26.0% with the gH counterparts of the human herpesvirus virus 1 （HSV1）, equine herpesvirus 4 （EHV4）, bovine herpesvirus 1 （BHV1）, pseudorabies virus （PRV）, gallid herpesvirus 2 （GHV2） and gallid herpesvirus 3 （GHV3）, respectively.     

驯鹿EGFR基因克隆及序列分析

以快速生长期雄性驯鹿(Rangifer tarandus)鹿茸顶端表皮组织为研究材料,提取其顶端表皮组织总RNA,参考GenBank数据库中牛、羊的表皮生长因子受体(EGFR)基因序列设计同源引物;采用RT-PCR技术、分子克隆技术首次成功获得雄性驯鹿茸顶端表皮组织EGFR基因编码区部分cDNA序列,片段大小为910 bp;Blast比对发现驯鹿EGFR基因与牛、羊、马、人、鲸、野猪的同源性分别是97%、96%、88%、86%、92%、89%,同源性均在85%以上,表明驯鹿EGFR基因在进化上比较保守;构建系统进化树发现驯鹿EGFR基因与牛亲缘关系最近,与人的亲缘关系最远;最后通过在线分析软件预测获得EGFR基因序列对应mRNA最小自由能二级结构。     

人参HMGR基因的克隆与序列分析

以人参根RNA为模板,根据其他植物HMGR基因序列保守区设计特异性简并引物,进行RT-PCR扩增。纯化回收HMGR基因RT-PCR产物与pMD18-T载体连接,再转化到JM109大肠杆菌中进行克隆,对阳性克隆菌重组质粒进行测序和序列分析。结果表明:人参HMGR核心片段的大小为458bp,与其他植物核苷酸序列有较高的同源性,依次为杜仲86.1%、南京椴83.8%、长春花83.2%、马铃薯82.5%、苹果82.1%、景烈白兰81.6%、肾叶橐吾81.6%、南苍术81.0%、红豆杉80.4%、水稻80.3%。