鮰爱德华菌外膜蛋白ompN2基因的克隆表达、分子特性与免疫原性分析

利用特异性引物扩增了分离自斑点叉尾鮰的鮰爱德华菌外膜蛋白ompN2基因并进行分子克隆,应用生物信息学工具对ompN2基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分子特性分析,并进行了目的蛋白的原核表达和免疫原性检测。结果显示:ompN2基因全长1 122bp(GenBank登录号为KP159419),包含1个完整的开放阅读框,编码373个氨基酸,其序列具有极高的保守性,与鮰爱德华菌外膜穿孔蛋白ompC同源性最高,序列一致性为100%,进化树聚为一支;具有1个革兰阴性菌穿孔蛋白(Gram-neg-porins)保守结构域,存在1个信号肽,不含跨膜区,是一种膜外蛋白;具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点20个和N-糖基化位点4个;具有9个与免疫相关的抗原决定簇区域,表明可以作为潜在的候选疫苗。此外,SDS-PAGE检测发现,该蛋白主要以包涵体形式表达在沉淀中,Western-bolt结果显示重组蛋白表达成功,且具有较好的免疫原性。以上结果为筛选ompN2作为斑点叉尾鮰抵抗鮰爱德华氏菌感染的疫苗候选基因并进行相应蛋白的表达提供了理论依据,同时为研究ompN2蛋白的生物学功能,了解ompN2基因结构与功能的关系奠定了基础。     

布鲁菌外膜蛋白Omp22基因的原核表达与生物信息学分析

克隆布鲁菌Omp22基因,原核表达后进行生物学信息分析。根据GenBank中羊种布鲁菌M5-90株基因组PCR扩增出639bp的目的基因片段,构建克隆重组质粒pMD-20T-Omp22,转化入E.coli DH5α。测序正确后构建表达重组质粒pET-28a-Omp22,转化入E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导表达,Western blot鉴定诱导融合蛋白。结果表明,成功克隆Omp22基因,构建pET-28a-Omp22原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达Omp22基因。DNA Man和BIOEDIT软件生物性息学分析Omp22融合蛋白二级结构中α-螺旋占22.17%;伸展链占19.81%;β-折叠占2.83%;无规卷曲占55.19%。说明该蛋白具有较高亲水性。     

布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析

克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。     

布鲁氏菌外膜蛋白2b基因的克隆、原核表达及蛋白生物信息学分析

本试验旨在克隆布鲁氏菌外膜蛋白2b（Omp2b）基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。根据布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp2b基因序列设计引物,以布鲁氏菌基因组为模板,通过PCR技术扩增得到Omp2b基因片段,回收纯化后,将此片段连接入pMD20-T质粒,将该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌提取质粒后,送公司测序。将该片段亚克隆入pET28a载体,构建pET28a-Omp2b表达载体,转化E.coli BL21（DE3）菌株,IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定此蛋白。运用DNAMAN、BioEdit等各种工具软件对Omp2b基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,成功克隆了Omp2b基因,其开放阅读框为1041 bp,编码347个氨基酸;构建了pET28a-Omp2b原核表达载体,并在E.coli BL21（DE3）中成功表达了Omp2b基因,表达蛋白约38 ku;Omp2b蛋白二级结构中α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占20.17%、26.22%、5.76%和47.84%。     

迟钝爱德华菌PuAH基因的原核表达及其部分特性分析

本试验旨在对迟钝爱德华菌EIB202 PuAH基因进行克隆表达,并对其部分特性进行分析。根据GenBank中发表的迟钝爱德华菌PuAH基因序列(登录号:CP001135,CDS编号:ETAE_0818)设计引物,克隆并通过表达载体pET32a重组表达该基因所编码的蛋白,纯化表达产物并制备兔抗血清,采用ELISA、Western blotting、溶血试验、菌体凝集试验分析所得融合蛋白的特性。结果显示,所得融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达,蛋白分子质量约为42 ku;具有免疫原性和抗原性,对鳗鲡红细胞不具溶血性,但融合蛋白抗血清对迟钝爱德华菌EIB202膜蛋白提取物的溶血性有一定的抑制作用,且可以凝集迟钝爱德华菌EIB202菌体。     

犬细小病毒VP2截短基因的原核表达及表达蛋白抗原性分析

采用PCR方法扩增了犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）2段VP2截短基因,将2段短基因片段分别克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,表达质粒命名为pET-32a-306和pET-32a-363。将pET-32a-306和pET-32a一363转化至宿主菌E．coliBL21（DE3）,IPTG诱导后进行SD孓PAGE和Westernblotting分析。结果显示,融合蛋白相对分子质量大小为30000和33000;与全长VP2蛋白相比,目的蛋白得到了高效表达,且都为可溶性表达。West—ernblotting结果表明,该蛋白融合表达并且有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。     

猫冠状病毒S蛋白生物信息学分析与原核表达

为了研发基于S蛋白的FCoV诊断试剂盒和疫苗,试验采用生物信息学分析方法分析表达FCoV S蛋白,确定含有抗原表位的蛋白可表达区域,并在大肠杆菌中原核表达重组蛋白,筛选重组蛋白表达条件,鉴定重组蛋白的免疫原性。结果表明：Ⅰ型FCoV S蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占25.82%、28.14%、4.23%和41.80%;有4个比较明显的亲水性区域与1个明显的疏水性区域;该蛋白质具有穿膜螺旋结构与信号肽,并存在3个可能性很高的N-糖基化位点与S蛋白表面存在46个氨基酸较为暴露的片段。以S蛋白1 127～1 400 aa片段作为体外表达目的片段,命名为S_1127-1400aa;重组蛋白最佳诱导温度为37℃、IPTG最佳诱导浓度为0.1 mmol/L、最佳诱导时间为5 h;重组蛋白以包涵体形式表达;成功纯化重组蛋白S_1127-1400aa;与FCoV阳性血清有良好的免疫原性。说明试验成功表达并纯化的FCoV S蛋白片段,该蛋白质具有良好的免疫原性。     

肠炎沙门菌avrA蛋白的原核表达及其生物信息学分析

【目的】 表达具有生物学活性的肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis） avrA蛋白,并对其进行生物信息学分析,为研究肠炎沙门菌avrA蛋白对猪肠道细胞免疫功能的影响提供参考。【方法】 根据GenBank中肠炎沙门菌avrA蛋白全基因序列（基因ID：1254388）设计引物扩增avrA基因,回收的目的片段与表达载体pGEX-4T-1进行重组、克隆,用限制性内切酶和基因测序验证重组表达质粒的正确性。将验证后的重组表达质粒转化大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞,并在不同条件下对重组表达菌进行诱导表达。应用SDS-PAGE和Western blotting检测avrA蛋白的表达情况。将酶切测序后目的基因序列进行BLAST比对分析,并用ExPASy-Translate Tool软件预测avrA蛋白的氨基酸组成。应用生物信息学软件预测avrA蛋白的跨膜结构域、二级结构、三级结构及抗原性。【结果】 肠炎沙门菌avrA基因CDS序列全长为909 bp,编码302个氨基酸。限制性内切酶及基因测序分析结果表明,重组表达质粒pGEX-4T-1-avrA构建成功。SDS-PAGE和Western-blotting结果表明,重组菌所表达的avrA蛋白为可溶性蛋白。重组菌在15 ℃诱导16 h表达的蛋白量为10 mg/L,蛋白溶解度为40%。生物信息学分析表明,avrA蛋白为膜外蛋白,该蛋白的16―301位氨基酸具有来自超家族YopJ丝氨酸/苏氨酸乙酰转移酶的保守结构域;avrA蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、延伸链分别占43.71%、39.40%和16.89%;avrA蛋白三级结构预测结果与二级结构一致;avrA蛋白有9个与B细胞结合的抗原表位,分别在第5―40、51―68、80―92、94、101―109、146―157、160―168、199―231和236―298位氨基酸处。【结论】 试验成功克隆出肠炎沙门菌avrA基因,并成功构建重组表达质粒和表达菌,诱导表达的avrA蛋白为可溶性表达;avrA蛋白为膜外蛋白,有9个能与B细胞结合的抗原表位。本研究结果为进一步制备检测肠炎沙门菌感染的抗体提供参考。     

鼠伤寒沙门菌毒力基因SptP的原核表达及生物信息学分析

【目的】试验旨在获得高效表达的鼠伤寒沙门菌SptP蛋白并进行生物信息学分析,为其功能研究和互作蛋白的筛选提供理论依据。【方法】通过PCR技术扩增SptP基因,并将该序列连接至pET-32a （+）载体,构建鼠伤寒沙门菌SptP基因原核表达载体pET32a-SptP。通过热激法将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达、纯化重组蛋白,并经过SDS-PAGE和Western blotting验证;应用在线软件对SptP蛋白进行生物信息学分析。【结果】PCR成功扩增出大小为1 632 bp的SptP基因。SptP重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功诱导表达、纯化,得到分子质量为79.7 ku的蛋白。SptP蛋白分子式为C₂₆₂₅H₄₂₅₇N₇₄₅O₈₁₂S₂₅,分子质量为60 047.68 u,无跨膜结构,无信号肽存在,理论等电点为8.75,有57个潜在的磷酸化位点,主要定位于细胞核、细胞质、高尔基体、细胞骨架、分泌系统的囊泡、质膜,占比分别为43.5%、34.8%、8.7%、4.3%、4.3%和4.3%。SptP蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角及无规则卷曲组成,占比分别为43.65%、14.92%、4.42%和37.02%。【结论】本研究构建了表达SptP蛋白的重组质粒pET32a-SptP,获得分子质量为79.7 ku的SptP重组蛋白,阐明了SptP蛋白的基本理化性质和生物学功能,为后续SptP蛋白与宿主细胞互作的作用机制及鼠伤寒沙门菌新疫苗的制备提供理论基础和试验依据。     

布鲁氏菌eryA基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

为分析羊种布鲁氏菌Rev.I株的基因结构、功能及作为诊断抗原的可能性,从Rev.I株基因组中扩增eryA基因片段,构建重组质粒pET-30a-eryA并进行原核表达、Western-blot检测,同时对该基因进行生物信息学分析。结果显示:本试验成功克隆并表达了eryA基因;经Western-blot检测发现,该基因编码蛋白可与阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性;生物信息学分析显示,该蛋白没有跨膜区结构,无信号肽,二级结构中α-螺旋比重最大;抗原表位分析显示:该蛋白含有较多的抗原决定簇。因此,推测eryA蛋白有望作为布鲁氏菌的免疫诊断抗原,这为进一步探索布鲁氏菌基因工程疫苗的研制及iELISA诊断试剂盒的建立奠定了基础。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。     

牛源犬新孢子虫NcSRS9基因的生物信息学分析及原核表达

为了解新孢子虫NcSRS9基因的生物信息学特性,本试验对牛源犬新孢子虫吉林株NcSRS9基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28α,构建了重组表达质粒pET-28α-NcSRS9,转化至大肠杆菌BL21中并诱导表达。结果显示,克隆的NcSRS9基因片段长969bp,与GenBank（EF440644.1）上发表的基因序列同源性100%。NcSRS9基因编码蛋白等电点为5.12,在其N末端存在一个跨膜区。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,NcSRS9基因在大肠杆菌内得到高效表达,表达的NcSRS9重组蛋白相对分子质量约为43 000（His约为7 000,NcSRS9约为36 000）,可被牛抗新孢子虫阳性血清识别,说明表达的蛋白具有一定的反应原性。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2全基因的克隆及原核表达

为研究猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2蛋白的结构与功能,自行设计引物,通过PCR扩增的方法,获得VP2全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a-VP2。将阳性重组质粒转化进RosettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为3~4 h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为68 ku,具有良好的免疫学活性。     

传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP3基因的克隆与原核表达

利用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因，将其克隆到表达载体pPRO^EX-HTa中，获得重组质粒命名为VP3／PA，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，插入的位置、大小和读码框均正确。SDS—PAGE检测表明，经重组质粒VP3／PA转化、诱导的受体菌E．coli DH5 α能表达结构蛋白VP3基因，约33 Ku，表达量达到了茵体总蛋白的33．9％，经Western blot等检测表明，诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV阳性血清发生特异性反应。这为IBDV血清学诊断方法的建立打下了基础。     

大肠杆菌多药耐药基因AcrA的克隆及其原核表达

从大肠杆菌AcrA的编码序列中设计引物,以大肠杆菌基因组为模板,扩增出AcrA基因中约691 bp的cDNA片段,将所得片段与pMD-18T载体连接,转化到DH5a大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道一致.从阳性克隆中提取质粒,经HindⅢ和BamH I酶解,回收691 bp的目的片段,定向克隆到pET-28a表达载体中,提取质粒,再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出AcrA部分基因的表达.     

鹅副粘病毒NP基因的原核表达及表达产物抗原性检测

根据GenBank中发表的GPMVSF02株的NP基因的核苷酸序列设计合成一对引物，通过RT-PCR扩增JS／1／97／Go株的NP基因，将其克隆人pMDl8-T载体，序列测定和分析表明：所扩增的NP基因的核苷酸长为1470bp，共编码490个氨基酸。再将NP基因定向亚克隆至原核表达载体pGEX-6P的多克隆位点，经酶切鉴定后将含有NP基因的阳性亚克隆重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，用诱导荆IPTG分别以不同的浓度进行诱导，并在不同的诱导时间进行采样，样品经处理后通过SDS-PAGE、Westernblot和Dot-ELISA进行分析。结果显示：以终浓度为1mmol／LIPTG进行诱导4h表达可达到高峰。表达的融合蛋白大小约为80kD，并具有良好的抗原性。     

犬新孢子虫AMA1基因的生物信息学分析及原核表达载体构建

为了解新孢子虫AMA1基因的生物信息学特性,并构建重组原核表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。本试验对牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体p GEX-4T-1,构建了重组表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。结果显示,克隆的Nc AMA1基因片段长1 695 bp,与GenBank(AB265823.1)上发表的基因序列同源性99.9%;Nc AMA1基因编码蛋白等电点为5.43,在其N端及C端分别存在一个跨膜区,为不溶性蛋白,且Nc AMA1蛋白抗原指数较高,有潜在疫苗研究价值。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白TbpB基因的克隆和表达

为了克隆和表达副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白TbpB基因,试验采用基因工程的方法对已发布的HPS外膜蛋白P5序列进行相关序列分析,设计并合成引物,以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS外膜蛋白P5编码基因,获得长为1 116 bp的预期基因片段。该基因编码372个氨基酸的蛋白质,预测分子质量约为41 ku,将该基因片段定向克隆至表达载体pGE X-6p-1中。结果表明:诱导表达后分子质量约为67 ku,与副猪嗜血杆菌阳性血清发生了特异性反应。说明该蛋白与抗体发生了反应,有一定免疫原性。     

流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增，得到了1条完整的基因，大小为642bp；测序分析证明，它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析，表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中，用IPTG进行诱导。结果证实，该基因可以在大肠杆菌中表达，表达产物为分子质量约50ku的融合蛋白，与理论推测的蛋白分子质量一致；Western—blotting试验证明，表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。