牛源犬新孢子虫NcGRA9基因原核表达及免疫原性分析

为了确定牛源犬新孢子虫NcGRA9基因的功能及表达蛋白的免疫原性,本试验PCR扩增牛源犬新孢子虫NcGRA9基因,构建克隆质粒pMD18-T-NcGRA9和原核表达质粒pGEX-4T-NcGRA9,转化大肠杆菌BL21感受态细胞中IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达重组蛋白的反应原性,应用重组蛋白与弗氏佐剂混合接种BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平。结果显示,经PCR扩增获得522 bp的NcGRA9片段,表达蛋白纯化后相对分子质量约为45 kDa,具有良好的反应原性;重组蛋白接种BALB/c小鼠后,免疫组小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平均极显著高于PBS对照组(P<0.01),说明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验表达的NcGRA9重组蛋白具有良好的抗原性,为新孢子虫病的防控奠定了基础。     

犬新孢子虫AMA1基因的生物信息学分析及原核表达载体构建

为了解新孢子虫AMA1基因的生物信息学特性,并构建重组原核表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。本试验对牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体p GEX-4T-1,构建了重组表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。结果显示,克隆的Nc AMA1基因片段长1 695 bp,与GenBank(AB265823.1)上发表的基因序列同源性99.9%;Nc AMA1基因编码蛋白等电点为5.43,在其N端及C端分别存在一个跨膜区,为不溶性蛋白,且Nc AMA1蛋白抗原指数较高,有潜在疫苗研究价值。     

牛源犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒的构建及鉴定

PCR扩增牛源犬新孢子虫NcAMA1基因,克隆至pMD18-T simple载体;将鉴定正确的NcAMA1基因亚克隆至pCR259腺病毒穿梭载体,构建重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1;依次转化HighQ-1Transpose-AdTM294和HighQ-1TM感受态细胞,构建NcAMA1基因重组腺病毒表达质粒T294-NcAMA1;PacⅠ酶线性化后,脂质体介导转染至QBI-HEK293细胞,包装Ad5-NcAMA1重组腺病毒。结果表明,获得Ad5-NcAMA1重组腺病毒滴度为5.6×109 TCID50/mL;经PCR检测到重组腺病毒NcAMA1基因;经IFAT和Western blot检测NcAMA1基因在QBIHEK293细胞中获得表达,表达蛋白相对分子质量为68 000,具有较好的反应原性。本试验成功构建了Ad5-NcAMA1重组腺病毒,为牛源犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定基础。     

牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的克隆及原核表达分析

为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD 18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-NcGRA7,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆,将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE和westem blot分析表达产物.结果表明,扩增的NcGRA7基因片段大小为701 bp,编码233个氨基酸,与GenBank中登录的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性为98.7％;western blot分析表达蛋白的分子量为52 ku,具有较好的反应原性.本实验为犬新孢子虫NcGRA7基因疫苗研究奠定了基础.     

牛源犬新孢子虫NcSRS9基因的生物信息学分析及原核表达

为了解新孢子虫NcSRS9基因的生物信息学特性,本试验对牛源犬新孢子虫吉林株NcSRS9基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28α,构建了重组表达质粒pET-28α-NcSRS9,转化至大肠杆菌BL21中并诱导表达。结果显示,克隆的NcSRS9基因片段长969bp,与GenBank（EF440644.1）上发表的基因序列同源性100%。NcSRS9基因编码蛋白等电点为5.12,在其N末端存在一个跨膜区。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,NcSRS9基因在大肠杆菌内得到高效表达,表达的NcSRS9重组蛋白相对分子质量约为43 000（His约为7 000,NcSRS9约为36 000）,可被牛抗新孢子虫阳性血清识别,说明表达的蛋白具有一定的反应原性。     

牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及在Vero细胞中表达

为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的生物学特性,本实验应用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫MAG1基因,构建真核表达重组质粒pVAX-MAG1,将鉴定正确的pVAX-MAG1重组质粒转染Vero细胞,应用间接荧光检测方法(1FA)和western blot技术检测MAG1基因在Vero细胞中的表达.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫MAG1基因长度为1047bp,与GenBank中登录的MAG1 (EF580924.1)核苷酸序列同源性为99％,IFA检测MAG1基因在Vero细胞中获得瞬时表达,western blot分析表达蛋白的分子量为39 ku,具有较好的反应原性.本实验为新孢子虫病核酸疫苗与诊断试剂盒的研究奠定了基础.     

表达牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

为构建牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSRS2基因,构建克隆质粒pMD18-T-NcSRS2、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcSRS2及表达质粒Transpose-AdNcSRS2,脂质体介导转染QBI-HEK293细胞,包装重组腺病毒Ad5-NcSRS2,PCR检测重组腺病毒NcSRS2基因,IFAT和Western blotting检测NcSRS2基因在QBI-HEK293细胞中的表达,测定病毒滴度后,收集病毒液免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫NcSRS2基因大小为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2( AF061249)核苷酸序列相似性为99％;重组腺病毒Ad5-NcSRS2在293细胞中包装成功,表达蛋白的相对分子质量为43 ku,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSRS2滴度为109TCID50·mL-1,间接ELISA检测二免后3周BALB/c小鼠血清中IgG抗体效价达1 ∶ 2 048.本研究成功构建了具有良好免疫原性的重组腺病毒Ad5-NcSRS2,为牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础.     

犬新孢子虫吉林株SAG1基因真核表达载体的构建

根据GenBank中已发表的犬新孢子虫SAG1基因序列(AF132217),设计了一对含有Kozak序列、起始密码子、终止密码子、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。以含有SAG1基因的重组质粒pMD-18T-SAG1为模板,经PCR扩增获得SAG1基因,利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该片段,回收含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点粘性末端的SAG1基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAX1真核表达载体中,获得重组质粒pVAX1-SAG1,经PCR鉴定、酶切分析和重组质粒的序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。     

牛源犬新孢子虫NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

为筛选牛源犬新孢子虫AMA1与虫体互作的靶蛋白,构建NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-AMA1。本试验应用RT-PCR技术从虫体总RNA中扩增了去除跨膜螺旋的AMA1基因,定向克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组诱饵载体转化酵母Y2H,并验证其在酵母细胞中毒性作用和有无自激活现象。结果显示:本试验成功构建了诱饵载体pGBKT7-AMA1,并证明其对酵母细胞无毒性,且对报告基因无自激活。结果表明:诱饵载体pGBKT7-AMA1可用于酵母双杂交系统筛选与虫体互作的宿主蛋白。     

犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建

根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。     

新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达

本研究根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,XhoI酶切位点,用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段（以下称dNcSRS2）,插入到pGEX-6p-1质粒的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切及PCR鉴定;经IPTG诱导在E.coli中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并纯化.结果表明,新孢子虫dNcSRS2基因体外扩增产物与预期值相符,约1041bp;所构建pGEX-dNcSRS2重组质粒经双酶切与PCR鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE和免疫印迹显示,表达融合蛋白的分子量约为62.6 kD,表达效率为32.3%,该蛋白具有特异的免疫反应性,为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和疫苗的研制奠定了基础.     

新孢子虫SAG1-SRS2融合基因真核表达质粒的构建及表达

根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。     

犬新孢子虫吉林株SAG1基因在BHK21细胞中的表达及免疫学评价

将构建成功的重组质粒pVAX-SAG1转染至BHK21细胞上,通过IFAT与RT-PCR方法检测重组质粒在BHK21细胞上的表达情况。大量提取重组质粒pVAX-SAG1,免疫Balb/c小鼠,分别在首免前、二免前、三免前以及三免后的第1、2、3周进行小鼠断尾采血,应用ELISA方法与流式细胞技术检测体液免疫水平和细胞免疫水平。结果表明,转染的重组质粒pVAX-SAG1在BHK21细胞中得到瞬时表达,并且重组质粒pVAX-SAG1免疫Balb/c小鼠后,在体液免疫水平上,pVAX-SAG1组与空载体pVAX1和PBS对照组差异极显著（P〈0.01）;在细胞免疫水平上,pVAX-SAG1组与PBS对照组差异显著（P〈0.05）。本试验为新孢子虫基因工程核酸疫苗的进一步研究奠定了基础。     

新孢子虫核糖体磷蛋白基因真核表达载体的构建及瞬时表达

采用PCR技术扩增出新孢子虫核糖体磷蛋白(NcP0)全长基因片段,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcP0表达载体。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染Vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的P0蛋白基因序列全长为1 379 bp;RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录;IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了NcP0的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了NcP0的瞬时表达。     

牛新孢子虫NcSRS2基因腺病毒穿梭载体的构建及在293细胞中的表达

应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。