仔猪大肠杆菌K88ac—ST1—LTB三价基因工程灭活苗的研究

产肠毒素性大肠杆菌所致的仔猪黄、白痢在我国广大养殖地区流行十分广泛 ,发病率和死亡率都很高 ,即便是病愈存活的仔猪 ,其生长发育和生产性能指标也会受到严重影响 ,给养猪业造成了极其严重的经济损失。我们利用基因工程技术将大肠杆菌菌毛Ｋ88ａｃ抗原基因与肠毒素ＳＴ1和ＬＴＢ 基因融合在一起 ,获得了高效表达Ｋ88ａｃ -ＳＴ1-ＬＴＢ 融合蛋白的基因工程菌株所表达的产物 ,既保持了Ｋ88ａｃ菌毛抗原和ＬＴＢ 肠毒素良好的免疫原性 ,又赋予了ＳＴ1的免疫原性 ,同时在构建过程中 ,通过定点突变使ＳＴ1丧失了原有的生物毒性 ,这样就可以从…     

仔猪大肠杆菌K88-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗的应用实验

对妊娠14~16周母猪颈部肌肉注射仔猪大肠杆菌K88-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗(以下简称三价灭活苗)的结果表明:三价灭活苗可以大大降低仔猪大肠杆菌的发病率和死亡率,差异极显著(P<0.01);对仔猪生长安全、无副作用;三价灭活苗的使用效果明显优于仔猪大肠杆菌K88-K99双价基因工程灭活疫苗(以下简称双价灭活苗); 疫苗现场应用免疫保护率明显高于双价灭活苗,差异极显著(P<0.01)。     

仔猪大肠杆菌K88ac-ST1-LT B三价基因工程灭活苗Ⅳ.保存期试验和田间试验

产肠毒素性大肠杆菌所致的仔猪黄、白痢在我国广大养殖地区流行十分广泛 ,发病率和死亡率都很高 ,即使是病愈存活的仔猪 ,其生长发育和生产性能指标也会受到严重影响 ,给养猪业造成了极其严重的经济损失[1～ 5] 。我们利用基因工程技术将大肠杆菌菌毛Ｋ88ａｃ抗原基因与肠毒素ＳＴ1和ＬＴＢ 基因融合在一起 ,获得了高效表达Ｋ88ａｃ -ＳＴ1-ＬＴＢ 融合蛋白的基因工程菌株 ,所表达的产物[7] ,既保持了Ｋ88ａｃ菌毛抗原和ＬＴＢ肠毒素良好的免疫原性 ,又赋予了ＳＴ1的免疫原性 ,同时在构建过程中 ,通过定点突变使ＳＴ1丧失了原有生物毒性 ,这…     

仔猪大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活苗Ⅲ.实验室生产与检验

由产肠毒素性大肠杆菌引起的新生仔猪黄、白痢 ,在我国乃至世界许多国家的广大养猪地区流行十分严重 ,有较高的发病率和死亡率 ,即使是病愈存活的仔猪 ,其生长发育和生产性能也会受到严重的影响 ,给养猪业造成了巨大的经济损失。仔猪黄、白痢的药物治疗不但价格昂贵、费工费力 ,而且效果不好 ;更因致病菌的抗药菌株日趋增多 ,用药往往无效 ,因而免疫预防是控制这类疫病的最佳选择[1,2 ] 。我们在原来从事ＳＴ1-ＬＴＢ 双价基因工程灭活苗的基础上[3～ 6] ,进一步利用基因工程技术将大肠杆菌菌毛Ｋ88ａｃ抗原基因与肠毒素ＳＴ1和ＬＴＢ 基因…     

仔猪大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活苗的研究Ⅱ.安全性试验和最小免疫剂量的测定

由产肠毒素性大肠杆菌引起的新生仔猪黄、白痢 ,在我国乃至世界许多国家的广大养猪地区流行十分严重 ,有较高的发病率和死亡率 ,即使是病愈存活的仔猪 ,其生长发育和生产性能也会受到严重的影响 ,给养猪业造成了巨大的经济损失。仔猪黄、白痢的药物治疗不但价格昂贵、费工费力 ,而且效果不好 ,更因致病菌的抗药菌株日趋增多 ,用药往往无效 ,因而免疫预防是控制这类疫病的最佳选择[1,2 ] 。我们在原来研究ＳＴ1-ＬＴＢ 双价基因工程灭活苗的基础上[3 ] ,进一步利用基因工程技术将大肠杆菌菌毛Ｋ88ａｃ抗原基因与肠毒素ＳＴ1突变基因和ＬＴＢ …     

大肠杆菌K88ac—STl—LTB三价基因工程菌株的构建

利用PCR技术，从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了合K88ac—ST1—LTB融合基因表达载体的重组菌株BL2l(DE3)(pXKST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实，构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac—ST1-LTB融合基因，是基因序列和阅读框架均正确。免疫试验结果表明，K88ac—ST1—LTB融合蛋白能够诱发机体产生抗体，该抗体具有中和天然STl肠毒素毒性的作用。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac，ST^ ，LT^ )的攻击。由此表明，构建的工程菌株BL2l(DE3)(pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的基因工程菌苗的候选株。     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶Ｅｃｏ ＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１,回收０．８４ｋｂ的ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因,再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将其与ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ,ＨｉｎｄⅢ,ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１。     

大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5).经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确.免疫试验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发机体产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素毒性的作用.用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗2 MLD的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac,ST+,LT+)的攻击.由此表明,构建的工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的基因工程菌苗的候选株.     

大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合基因表达条件的优化

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含K88ac-ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下K88ac-ST1-LTB融合基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pETXKSL3含有K88ac-ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,同时以IPTG为诱导剂诱导K88ac-ST1-LTB融合基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果:培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度1.0 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间3 h,此时K88ac-ST1-LTB融合蛋白表达量为35.2%。本文实现了K88ac-ST1-LTB融合基因的高效表达,并为大肠杆菌肠毒素三价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

仔猪腹泻源大肠杆菌贵州株K88菌毛研究

通过玻片凝集试验、抗Ｄ－甘露糖微量血凝试验（ＭＲＭＨ）、离体细胞粘附试验、菌体蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）和免疫印迹、质粒ＤＮ民泳等。分析了仔猪腹泻源大砀杆菌贵州株（４０９－１１）所产Ｋ８８菌毛的血凝谱、对肠上皮细胞粘附特性、菌毛蛋白单位分子量,并对其Ｋ８８基因进行了初步定位。结果表明：其所产Ｋ８８菌毛的血凝谱能凝集豚鼠和允许红细胞;能介导细菌粘会于仔猪离体肠上皮细胞,这种粘附作用     

仔猪大肠埃希氏菌腹泻K88-LTB双价基因工程活疫苗-15℃保存期试验

本试验从本厂历年生产的仔猪大肠埃希氏菌腹泻K88-LTB双介基因工程活疫苗的产品留样中，随机抽取-15℃保存26-65个月的14批疫苗进行活菌计数，并对其中保存26-47个月的4批疫苗进行了特异性抗原检查、效力检验和安全性测定。结果表明，保存后的活菌数与原菌数相比没有明显降低，K88、LTB抗原检查均呈阳性，效力检验和安全性测定也达到《规程》规定的标准。     

K88—LTB双价工程菌苗的免疫效果及免疫母猪外周血ANAE^＋T细胞动态

用Ｋ８８－ＬＴＢ双价工程菌苗免疫妊娠后期母，然后采用酸性ａ－醋酸萘酯酶染色试验检测了实验母猪外周血ＡＮＡＥ＾＋Ｔ细胞动态变化。结果表明：Ｋ８８－ＬＴＢ双价工程菌苗免疫母猪后，其新生仔猪的大肠杆菌性腹泻的发病率和死亡率可大幅度降低。免疫母的细胞免疫功能增强，辅助性Ｔ细胞参与了体液免疫应签反应的辅助与调控，即Ｋ８８－ＬＴＢ可以激发Ｔ细胞辅助的体液免疫应答反应。     

大肠杆菌MM—3基因工程活菌苗免疫母猪所产仔猪抗K_(88ac)及抗LTB抗体动态

应用BA-ELISA,分别检测了用大肠杆菌MM-3基因工程活菌苗免疫妊娠92d母猪所产仔猪血清和消化液中抗K_(88ac)及抗LTB抗体的动态消长.结果表明,新生仔猪在吃初乳后24h内,血清及消化液中抗K_(88ac)及抗LTB抗体水平均很高,但以后逐渐下降,1周后IgM、2～3周后IgA、3～4周后IgG分别下降到最低水平;仔猪35日龄时,抗体水平有所回升.消化液中抗体水平比血清中抗体水平下降快,并与母体乳汁中的抗体水平呈正相关关系.     

表达无毒性大肠杆菌ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用基因突变技术，将形成ST1分子内二硫键的半胱氨酸碱基进行突变，使ST1失去本身毒性，进而将其与含有LTB基因的pET-28b( )连接，转化至受体菌BL21(DE3)，重组菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)经IPTG诱导后，其表达产物免疫的小鼠能够抵抗大肠杆菌强毒菌的攻击并且消除了ST1的毒性，表明构建的工程菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)可作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选菌株。     

K88、K99、987P仔猪大肠杆菌菌种的提纯和保存

由产肠毒素性大肠杆菌感染而引起的仔猪急性下痢分布十分广泛,本病主要危害一月龄以内的新生仔猪,尤其是一周龄以内的仔猪发病率和死亡率最高,多以急性、水样腹泻为特性。随着大型集约化养殖业的发展,病原性大肠杆菌对畜牧业所造成的损害已日益明显。产肠毒素性大肠杆菌含K88、     

仔猪黄痢K88、K99基因工程菌、987P无毒菌三价苗的研制

仔猪黄痢主要危害1月龄以内的新生仔猪,尤其是1周龄内仔猪的发病率和死亡率最高,多以急性、水样腹泻为特征,预防仔猪黄痢最有效的措施是采用疫苗对怀孕母猪免疫接种,新生仔猪通过吮吸母猪初乳获得被动免疫。本疫苗是通过分别带有K88、K99、987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌,接种于适