小麦品种(系)与小麦白粉菌的相互作用——Ⅰ.小麦白粉菌毒力频率和毒性基因的研究

1985—1987年在温室条件下,采自河南省不同地区的小麦白粉菌群体,对本省当前推广的小麦品种的毒为频率均大于76.55%;区试品种(系)中的花培28和周80—48的毒力频率分别为6.25%和8.75%,抗性较好.利用联合致病性分析,确定了花培28与百泉792、郑州7920和周80—48是今后适于推广的品种组合.研究初步证明豫东、西、南部的小麦白粉菌群体结构基本相似.毒性基因V_1、V_(3b)、V_(3c)、V_5和V_9的平均频率较高(66.67—82.76%),V_2、V_(2x)、V_4、V_(4(+))和V_8的平均频率低(7.06—13.38%).并讨论了小麦品种的合理布局和抗源利用等问题.     

小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析

WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。利用cDNA宏阵列(macroarray)和RT-PCR相结合的方法,从小麦全长cDNA文库的WRKY转录因子中筛选出一个应答小麦白粉病菌胁迫的TaWRKY34转录因子,该基因编码464个氨基酸。染色体定位分析表明,该转录因子位于小麦第一同源群染色体的短臂上,并且只在细胞核中表达。其蛋白序列与拟南芥、大麦和葡萄抗病相关WRKY转录因子的亲缘关系较近,与其中的3个WRKY基因具有相似的表达模式。TaWRKY34在Pm16/北京8377抗白粉病近等基因系中,对小麦白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导的表达模式存在差异。TaWRKY34可能与小麦对白粉菌的抗性有关。     

小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达

细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制, 在植物生长、发育和逆境响应等过程中均扮演了重要角色。自噬相关蛋白ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。利用同源克隆方法, 从经白粉病菌诱导48 h的小麦材料92R137/扬麦158⁷中克隆了ATG10基因家族3个成员(TaATG10a、TaATG10b和TaATG10c)。序列特征分析、物种间的比较和进化分析, 以及酵母功能互补实验结果证实, 这3个基因均为酵母ATG10的功能性同源基因。TaATG10a和TaATG10b的基因组序列具有相似的6外显子-5内含子基因结构。RT-PCR分析还发现这2个基因都具有2种可变剪接产物。TaATG10a和TaATG10b的GFP融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。白粉菌侵染能够诱导TaATG10a和TaATG10b表达, 因此推测, 小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对TaATG10及其参与的自噬过程的调控, 其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的感病反应而差异明显, 说明TaATG10及其参与的自噬过程与小麦-白粉菌互作反应关系的复杂性。从外源激素处理诱导的表达情况还发现, 抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或ABA)信号的不同响应模式。     

转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定

利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶双价基因导入小麦品种扬麦10号和Bobwhite,共得到了13株T0代转基因植株,2个小麦品种的转化效率分别为1.4%和1.0%.T1代植株赤霉病抗性鉴定结果表明,转基因植株对赤霉病具有一定抗性,小穗发病率4.76%～11.76%,低于抗病对照和感病对照.T1代植株分子检测结果表明,外源基因分离比例为2.33∶1,较低的分离比例可能与外源基因的丢失有关.     

转几丁质酶和b-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定

利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和b-1，3-葡聚糖酶双价基因导入小麦品种扬麦10号和Bobwhite，共得到了13棵T0代转基因植株，2个小麦品种的转化效率分别为1.4%和1.0%。T1代植株赤霉病抗性鉴定结果表明，转基因植株对赤霉病具有一定抗性，小穗发病率4.76%～11.76%，低于抗病对照和感病对照。T1代植株分子检测结果表明，外源基     

TcLr35小麦β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长的克隆及分析

根据已发表的植物β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病基因近等基因系材料TcLr35中获得一个β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长,命名为PR34,该基因全长序列为1416bp,具有一个编码335个氨基酸的开放阅读框(ORF),其起始密码子ATG位于13bp处,终止密码子TAG位于1015bp处,3'末端有20bp的poly(A)尾,379bp的3'非翻译区。与GenBank中小麦、大麦等多个葡聚糖苷酶基因具有较高同源性;对其推断的氨基酸序列进行分析,含有Glyco_hydro_17保守结构域,为葡聚糖苷酶基因蛋白结构域。Southern杂交显示,该基因在TcLr35小麦基因组中为低拷贝。     

栽培小麦Brock和京411感染白粉菌后蛋白质组的变化

用华北地区流行的白粉菌15号生理小种,感染强抗白粉病的栽培小麦Brock和对白粉病敏感的小麦京411,通过蛋白质组技术分析其差异蛋白。结果表明,Brock经白粉菌感染12 h后,至少有6个蛋白质斑点(43 kD/pI 6.7、43 kD/pI 6.9、43 kD/pI 7.2、28 kD/pI 5.8、26 kD/pI 5.5和26 kD/pI 6.5)表达量明显增加;感染3 d后,有5个蛋白质斑点(48 kD/pI 5.6、43 kD/pI 6.9、43 kD/pI7.2、28 kD/pI5.8和26 kD/pI5.5)表达量增加;感染5 d后,有12个新的蛋白质斑点(16 kD/pI 7.6、42 kD/pI 6.5、40 kD/pI 4.8、40 kD/pI 4.6、31 kD/pI 5.7、16 kD/pI 4.6、20 kD/pI 8.3、50 kD/pI 6.7、48 kD/pI 6.6、28 kD/pI 5.7、23 kD/pI 4.8和25 kD/pI 4.7 )被诱导合成,2种蛋白质斑点(26 kD/pI 4.6和17 kD/pI 7.9)消失。京411经白粉菌感染12 h后,3个蛋白质斑点(21 kD/pI 6.4、18 kD/pI 5.4和14 kD/pI 7.0)表达量增加;感染3 d后,有2个蛋白质斑点(80 kD/pI 5.4和14 kD/pI 7.0)表达量增加,1个蛋白质斑点(16 kD/pI 5.4)表达量下降;感染5 d后,有3个蛋白质斑点(50 kD/pI 7.3、40 kD/pI 7.3和24 kD/pI 7.2)表达量增加,2个斑点(40 kD/pI 4.8和14 kD/pI 7.2)表达量下降,但没有发现新的蛋白质合成。对Brock中诱导产生的12个新蛋白质斑点,利用MALDI-TOF-MS方法,于NCBI进行数据查询,其中有6个分别属于F-box亮氨酸高度重复蛋白、重金属转运/解毒蛋白、β-1,3-葡聚糖酶(两个同工体)、β-1,3-葡聚糖酶前体、锌指蛋白。功能查询表明,上述6个蛋白参与细胞周期调控、发育、激素响应、基因转录和病害防御等。推测Brock和京411感染白粉菌后,出现的蛋白质组变化可能与各自的抗、感白粉病特性有关。     

小麦返白系相关基因的克隆与表达

为研究小麦返白系阶段性“白化-复绿”的分子机制,以中国春小麦叶绿体基因组序列的LSC区为参考序列,分段设计引物,PCR扩增中国春、矮变1号、返白系的相应基因片段,在返白系中获得特异基因片段WFC01.提取中国春、矮变1号幼嫩叶片和返白系白化及复绿叶片总RNA,毛细管法转膜,WFC01为探针进行Northern杂交.结果表明,与对照矮变1号和中国春相比,返白系随着叶片的白化,WFC01基因片段的表达受到明显抑制,几乎无表达,随着叶片的复绿,WFC01基因片段的表达恢复正常,与对照表达量一致,表明该基因的表达与返白系的阶段性白化、复绿有关.     

小麦TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定

WRKY是植物特有的转录因子基因, 在植物对外界胁迫响应及生长发育的过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个新的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY44, 获得其全长cDNA, 其中开放阅读框长度为897 bp, 编码298个氨基酸。半定量RT-PCR的结果表明, TaWRKY44在叶片中表达水平较高, 并且受干旱和低温胁迫诱导表达。转基因功能分析结果表明, TaWRKY44的拟南芥超表达株系叶片变小, 叶柄缩短, 并且叶片细胞也明显小于野生型。另外, 转基因系对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性也高于野生型, 说明该基因可能作为一个转录抑制子参与逆境胁迫信号转导过程。     

黄瓜苯丙氨酸解氨酶基因CsPAL的克隆及响应白粉菌侵染的表达分析

为了分析苯丙氨酸解氨酶基因(CsPAL)在黄瓜侵染白粉菌中的转录应答响应,对CsPAL基因(GenBank No.JN 675927)及其启动子进行了克隆与序列分析,再利用qRT-PCR技术分析了该基因在黄瓜高抗白粉病品种‘Jin5-508’接种白粉菌后不同时间的相对表达量。结果表明:CsPAL基因全长2 142 bp,编码713个氨基酸;推测CsPAL蛋白存在于细胞质中;系统发育进化树分析发现与拟南芥基因进化距离较近;启动子克隆及序列分析显示该基因能够响应真菌的侵染;组织特异性表达发现CsPAL在在叶片中的表达量最高;qRTPCR结果表明‘:Jin5-508’叶片在接菌16 h内,CsPAL基因的相对表达量于对照间无显著差异;接菌16 h后,CsPAL基因表达量迅速上升,显著高于对照,并在24 h达到最大值;接菌48 h后,CsPAL基因的表达量逐渐下降,但在96 h内仍显著高于相应对照的表达量。综上所述,黄瓜CsPAL基因为白粉菌侵染响应基因,可能与黄瓜对白粉病的抗性具有一定的相关性。     

小麦抗白粉病新基因的AFLP和SSR标记及其染色体定位

M53 (YAV2/TEZ//Ae.squarrosa 249) 是硬粒小麦与粗山羊草的双二倍体合成种,携带一个抗白粉病新基因,暂命名为Pm-M53,该基因对北京地区白粉病优势生理小种15号表现免疫抗性。本研究利用来源于杂交组合M53/宛7107的一个F₂群体,在苗期采用白粉病15号小种（Blumeria graminis f. sp. tritici）接种,抗病反应型鉴定表明,抗感比例符合3∶1,说明其抗性受显性单基因控制;对部分F₂植株的F₃株系的抗病鉴定进一步证明了F₂鉴定的可靠性;利用AFLP和SSR标记技术结合F₂分离群体对目的基因进行了遗传作图,将目的基因定位在5D染色体的长臂上。其中AFLP标记P16M16_-109(Apm109)和P5M16_-161(Apm161)与目的基因的遗传距离分别为1.0和3.0 cM。SSR标记Xwmc289b、Xgwm583和Xgwm292与目的基因的遗传距离分别为20.0、33.0和24.0 cM。这些标记位于目的基因的两侧。利用中国春遗传背景的缺-四体和双端体结合AFLP标记Apm109确证了SSR标记定位的可靠性,进一步证明该基因是一个新的抗白粉病基因。     

白粉病菌侵染后小麦叶片蛋白质变化的研究

利用双向电泳技术,分析了高感白粉病和对白粉病表现免疫的2种小麦在接种白粉病菌前后的叶片蛋白的变化。结果表明:无论抗病小麦Pm3b还是易感小麦Chancellor,在白粉菌接种前后,叶片蛋白都有明显变化。都有部分蛋白消失。对于抗病小麦Pm3b,在白粉病菌接种后,在电泳图谱上还发现诱导产生许多新的叶片蛋白。经统计,在白粉菌接种后,抗病小麦Pm3b的叶片诱导产生至少20个新蛋白。推测可能与小麦受白粉病菌诱导后一些抗性蛋白大量表达有关。     

源于长穗偃麦草的小麦新品系CH7034抗白粉病基因的染色体定位

CH7034是一个兼抗小麦白粉病和条锈病的新种质材料,通过普通小麦与八倍体小偃麦"小偃7430"杂交、回交选育而成.为明确其白粉病抗性的遗传机制及抗性基因的染色体位置,用小麦高感品系"SY95-71"与CH7034杂交,所获F1、F2及其双亲在温室用白粉病E09菌系的15号小种接种,对CH7034的白粉病抗性进行鉴定和遗传分析.结果表明,无论是苗期还是成株期,CH7034对白粉病菌均表现为免疫,且具有与其抗性供体小偃7430及野生亲本长穗偃麦草相似的白粉病抗性,F1代抗病反应型为O或O'级,F2代抗感分离比符合R:S=3:1,说明CH7034抗性受显性单基因控制.用307对小麦微卫星引物对一个148株的F2群体进行分析,发现小麦微卫星标记xgwm311与抗病基因连锁,遗传距离为12.4 cM.用中国春缺-四体和双端体材料进一步验证与抗病相关的片段位于2A染色体的长臂上,进而将CH7034所含的抗白粉病基因定位于小麦的2AL上.     

12个小麦品种(系)白粉病抗性的遗传分析

利用17个不同来源和毒力的白粉菌菌株对12个小麦品种(系)进行苗期抗性鉴定和抗病性遗传分析,同时利用Pm2和Pm8基因的特异分子标记检测了相应基因。供试的12个品种至少能够抗11个白粉菌菌株。用E09、E20和Bg2菌株接种F₂群体,抗感植株分离比例和适合性测验证明这12个品种对不同白粉菌菌株的抗性均受1对显性基因控制。抗谱分析和基因紧密连锁分子标记(Xcfd81)分析表明良星66很可能含有Pm2或其等位基因。ω-黑麦碱基因(1RS染色体)和Glu-B1基因(1BS染色体)特异分子标记分析结果证明,山农20和郑麦9962含有T1BL·1RS易位染色体,即可能携带Pm8基因。由于Pm8基因对大多数菌株表现感病,所以这2个品种除Pm8外,还具有其他抗病基因。偃展4110与天民668对参试菌株的反应型表现一致,其他材料对不同菌株的反应型表现不同。     

小麦新品种济麦22抗白粉病基因的分子标记定位

为明确济麦22携带抗白粉病基因的染色体位置,利用济麦22与感病亲本中国春杂交,用小麦白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)强毒性小种E20对F₂抗、感分离群体和F_2:3家系进行抗病鉴定和遗传分析。结果表明,济麦22携带1个显性抗白粉病基因, 暂被命名为PmJM22。运用SSR和EST标记及分离群体分组分析法(bulked segregant analysis, BSA),将其定位在2BL染色体上,与4个SSR和5个EST标记间的连锁距离为7.7 cM (Xwmc149)到31.3 cM (Xbarc101)。通过分析2BL上其他抗白粉病基因的来源、染色体位置和抗性反应,认为PmJM22不同于Pm6、Pm26、Pm33和MlZec1。     

小麦地方品种小白冬麦抗白粉病基因分子标记

小麦农家品种小白冬麦对小麦白粉病具有良好抗性,对病原菌拥有较广的抗谱,并与其他已知抗白粉病基因的抗谱不同,遗传分析证实小白冬麦的苗期抗性由一个隐性抗白粉病基因控制。为了寻找与小白冬麦所携带抗白粉病基因连锁的分子标记,采用小白冬麦和感病品种Chancellor(CC)正反交组合,在2个F₂群体125和107个单株上进行验证。结果显示,抗白粉病基因mlxbd与引物Xgwm577、Xgwm1267等紧密连锁,通过中国春及其第7部分同源群缺体-四体系,双端体系和缺失系将其定位在7B染色体长臂末端区域(7BL-10,Bin 0.78~1.00), 利用与mlxbd最近的引物Xgwm577扩增23个含有已知抗白粉病基因的小麦品种,检测发现这个引物不能单独用于分子标记辅助选择育种。     

大麦DNA导入小麦诱导抗白粉病变异的研究

本试验利用外源DNA导入技术,研究了大麦DNA导入小麦品种后,D_1,D_2和D_3代的抗白粉病变异株(系)在不同条件下的抗性表现及产量构成、籽粒蛋白质和氨基酸含量的变化。试验结果表明,导入外源DNA的D_1代小麦檀株出。现了抗白粉病等多种变异类型,其中免疫和高抗白粉病变异株古2.77％,且抗性能够向子代传递,其D_2代在大田自然发病和温室接菌条件下,有5个株系抗性保持稳定,8个株系有分离,其中一个株系在D_2和D_3代抗性均稳定。在田间D_2代有2个稳定株系(D_2-20,D_2-29)的籽粒粗蛋白质含量,比受体分别高20.3％和15.76％,17种氨基酸总量分别高23.4％和27.5％。在温室这些性,状的数值也明显高于受体。     

与小麦抗白粉病基因Pm48紧密连锁分子标记的开发

Pm48为本实验室鉴定的一个抗白粉病新基因。为精细定位该基因,利用混池ddRAD测序鉴定了81个与该基因关联的序列,开发了STS标记Xmp931,转化了CAPS标记Xmp928、Xmp930和Xmp936;同时,利用粗山羊草基因组序列开发了71个基因组SSR标记,定位了其中的Xmp1089和Xmp1112。在115个宁糯麦1号′Tabasco衍生的F2:3家系中,Xmp928与目的基因共分离,Xmp1112位于近着丝粒方向处距抗病基因3.1 c M。在671个纯合感病家系中,标记Xmp928仍与目的基因共分离。利用3个中国春5DS缺失系,最终将Pm48定位在小麦5DS上0.63–0.67的臂区段中。     

小麦抗白粉病SSH-cDNA文库中差异基因的表达模式

为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制,构建了白粉菌接种初期的抑制性消减杂交cDNA(SSH-cDNA)文库。从中随机挑取140个阳性克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列后,得到94条EST,利用NCBI的BLAST在线序列比对工具对GenBank的蛋白质数据库进行同源性比对及功能分类。结果表明,49个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗病与防御(30%)。经文库比较,筛选出与病程相关蛋白基因同源的EST(Z25-1)和与谷胱甘肽硫转移酶同源的EST(Z440-1),GenBank登录号为EX567369和EX567360。以其EST序列为依据设计引物,通过RT-PCR分析它们在白粉菌诱导下的表达模式,结果该2基因表达存在明显差异。其中,Z25-1在未接种白粉菌时具有一定的表达量,白粉菌侵染后表达量开始上升,侵染72 h时表达量最高,然后下降;Z440-1在未接种时也具有一定的表达量,但在接种初期表达微弱,甚至不表达,24 h后表达开始上升,到72 h时达最高,然后下降。本研究表明,病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因,且参与白粉病抗病反应,在白粉菌诱导72 h时表达量最高。