RNAi的抑制物及其应用

在植物、动物中广泛存在的一种基因调控现象,RNAi现象是通过调控RNA的分子水平来抑制基因表达。被认为是一种抑制病毒性复制和转座子活动的抗御机制。在此过程中,侵染型病毒为了能够不被这种机制干扰抑制,继续在寄主体内生存、繁殖,则产生了一种反抗御机制———即产生抑制蛋白来对抗转录后基因沉默。本文集中讨论了当前已知的植物病毒编码的沉默抑制物。它们在抑制途径中的不同阶段干扰沉默,这些抑制物已成为一种有力的工具来帮助了解植物中RNA沉默的机制,并在研究基因功能等方面有着广泛的应用前景。     

美国白蛾HcSID-1基因的克隆、表达模式分析及其在幼虫中的功能验证

【目的】克隆美国白蛾系统性RNA干扰缺失基因序列,对该基因进行序列特征分析和时空表达模式检测,并研究其在美国白蛾幼虫系统性RNA干扰中的功能。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从美国白蛾幼虫中进行基因克隆,并进行生物信息学分析;利用qPCR技术检测该基因在美国白蛾不同发育阶段和幼虫不同组织中的相对表达量;利用RNAi和qPCR技术验证外源dsRNA对该基因的干扰效率,以及干扰该基因表达后对其他靶标基因干扰效率的影响。【结果】从美国白蛾幼虫中克隆得到一个美国白蛾系统性RNA干扰缺失基因并命名为HcSID-1(Gen Bank登陆号:MG696730)。该基因全长2 761 bp,开放阅读框(ORF) 2 613 bp,编码870个氨基酸,预测蛋白分子量为97. 08 kD,理论等电点(pI) 6. 81,有1个19 aa的信号肽。氨基酸序列分析表明,Hc SID-1蛋白有1个长N末端(308 aa),序列中后段309—855位氨基酸之间具有典型的11个跨膜结构域;系统进化分析表明HcSID-1与鳞翅目昆虫同源性较高,和家蚕的Bm SID-3亲缘关系最近;时空表达分析表明,HcSID-1在美国白蛾各发育阶段和幼虫各组织中均有表达,在幼虫中肠组织表达量最高。注射HcSID-1 dsRNA可显著降低该基因在转录水平的相对表达量,且该基因的下调能降低HcChi dsRNA在美国白蛾幼虫中的RNA干扰效率。【结论】获得具有典型家族特征的美国白蛾SID-1基因序列,该基因的下调能够影响其他靶标基因dsRNA的RNAi效率,表明该基因可能具有与其他SID基因在系统性RNAi过程中相同的功能。     

白蜡虫ws基因RNAi载体构建及原核表达dsRNA

[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsRNA(doublestranded RNA,dsRNA)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsRNA。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质粒转入大肠杆菌HT115感受态细胞,经IPTG诱导获得与目的片段相对应的dsRNA。[结果]白蜡虫ws基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体成功构建,重组质粒转入HT115感受态细胞经IPTG诱导后菌体成功表达dsRNA,dsRNA的平均获得量1 705 ng·m L~(-1)。[结论]该研究通过原核表达白蜡虫ws基因的dsRNA,为后续利用RNAi实验研究白蜡虫ws基因功能及作用机理奠定基础。     

中华紫胶虫FAD基因RNA干扰载体构建与功能初步分析

[目的]引入细菌表达dsRNA干扰系统对中华紫胶虫FAD基因进行RNA干扰,通过检测干扰后FAD基因表达量与个体泌胶量动态变化,对FAD基因功能进行初步分析,为验证紫胶合成相关基因功能提供科学基础。[方法]中华紫胶虫FAD基因和L4440载体经双酶切之后,利用T4连接酶连接,构建FAD-L4440重组质粒,并转入HT115感受态细胞中,IPTG诱导表达dsRNA后,通过虫体涂抹法将dsRNA转染到紫胶虫体内。用RT-qPCR检测干扰后FAD基因的表达量并测定干扰后个体泌胶量的变化。[结果]RNA干扰后FAD基因表达量明显降低,其中,以低浓度菌液处理后12 h和中浓度菌液处理后24 h相对于对照组有显著差异,分别降低了90.90%和86.52%,中浓度在72 h时干扰效率高于其他两个组,个体泌胶量与对照组比较有显著下降。[结论]本研究构建了中华紫胶虫FAD基因的RNA干扰载体,在基因功能验证中引入了细菌表达dsRNA的RNAi系统,使用虫体涂抹法将其导入虫体内引起FAD基因表达量与紫胶虫个体泌胶量显著下降,为RNAi转染过程中不适用注射法、喂食等转染方法的昆虫提供技术参考,为后续解析紫胶合成的分子机理提供技术基础与科学依据。     

RNAi技术防治害虫的研究进展

利用RNAi技术来防治害虫成了人们研究的热点之一。RNAi可分为细胞自主性的和非细胞自主性的。对应用RNAi技术防治害虫来讲,研究的焦点集中在非细胞自主性RNAi,即昆虫能通过取食来内化目标基因的dsRNA。RNAi技术防治害虫的特异性极高,不会出现残留污染问题。可以通过注射、饲喂和转基因dsRNA来进行害虫的防治。本文还介绍了昆虫吸收dsRNA的机制。     

樟树不同组织总RNA提取方法比较及RT-PCR检测

采用Invitrogen Total RNA Purification Kit直接提取法,Trizol试剂盒法和本实验室改良的CTAB法,分别提取樟树不同组织(根、茎、叶和花)的总RNA,并对提取效果进行了检测和比较分析。结果表明:(1)采用本实验室改良的CTAB法提取的RNA完整性好,无杂质污染且得率高,稳定性好,可满足半定量RT-PCR等试验需要;而Invitrogen Total RNA Purification Kit直接提取法和Trizol试剂盒法提取的樟树不同组织总RNA,结果均不理想,存在RNA 28S rRNA谱带模糊不清、有DNA污染、降解严重和得率低等问题,这两种方法均不适用于樟树不同组织RNA的提取。(2)樟树不同组织总RNA提取的得率不同,其中叶片的总RNA得率最高,达到782.34 mg/kg;茎的得率最低,为514.33 mg/kg。(3)以Actin作为内参基因,对樟树根、茎、叶和花中的Fad2基因片段进行半定量RT-PCR检测,结果表明,Fad2基因片段在樟树叶片中的表达量相对较高,而在花中的表达量较低。     

美国白蛾几丁质酶细菌表达的RNA干扰载体构建及其介导的RNA干扰

[目的]探索细菌表达dsRNA介导的RNAi在美国白蛾中的可行性,为RNAi技术在美国白蛾等林业害虫上的应用提供依据。[方法]选择几丁质酶HcChi基因作为靶标,设计有效的干扰片段,构建到L4440干扰载体上,并转入HT115大肠杆菌菌株。IPTG诱导HT115表达HcChi的干扰片段,用菌液持续饲喂美国白蛾幼虫,观察幼虫生长情况,定量PCR检测HcChi的转录水平。[结果]构建了带有HcChi-L4440表达载体的HT115菌株,经IPTG诱导能够合成HcChi-dsRNA,浓缩菌液持续饲喂幼虫显著抑制HcChi的表达,相对表达量显著下降了76.7%～90.3%,幼虫生长发育迟缓,体重增长量与对照相比显著减小40.7%。[结论]成功构建HcChi RNA干扰载体,通过饲喂法在美国白蛾中获得RNAi效应。该体系首次在美国白蛾中建立,为该物种的基因功能研究和生物防治提供新思路。     

基因工程对改良观赏植物品质的研究进展

基因工程技术已在观赏植物的花色、花形、花香、花期、抗性等方面大量应用并取得了较大的进展,为花卉的性状和品质改良提供了全新的思路和手段。作者就近年来基因工程技术在观赏植物品质研究方面进行了综述,并对观赏植物基因工程存在的问题进行了探讨。     

开发转基因作物市场前景看好

科学在发展，社会在进步，人类文明在升华。转基因技术是人类文明高度发达、科学技术高速取得进展的标记，它标志着人类驾驭自然能力新的飞跃。当前为加快农作物新品种的培育推广，以满足人口不断增长的需求，是全世界发展中国家发展生物技术的一个共同目标。时至今日，基因工程技术改良农作物方面已取得重大进展，一场新的绿色革命近在眼前。这场新的绿色革命的一个显著特点就是生物技术、农业、食品和医药行业将融合到一起。基因工程技术的突破不仅使得作物遗传改良的步伐大大加快，而且还可以打破种属间的界限，创造出前所未有的新性状，新品种。目前，植物基因工程技术改良的作物品种已进入了商业化阶段；全球种植转基因作物的面积增长迅速，种植转基因作物的国家和作物的种类也在不断增加。     

油茶种子总RNA提取及Cod8FAD基因的鉴定

油茶种子胚乳中富含脂肪、多糖和酚类公合物,要获得高质量的RNA难度较大。本研究以油茶优良无性系湘林1号近成熟种子的胚乳为实验材料,在试剂盒的基础上应用改良的CTAB法提取总RNA。结果表明,使用改良后的CTAB法配合试剂盒提取RNA操作简单,且能够有效去除油茶种子中多糖和多酚类等次生物质,从而得到高质量的RNA。以获得的RNA为模板,设计简并引物,通过RT-PCR,成功从油茶种子中鉴定出了油脂合成的关键酶基因之一△8脂肪酸脱饱和酶基因,命名为Cod8FAD(Camellia oleifera delta 8 fatty acid desaturase),该基因与茶树△8脂肪酸脱饱和酶基因相似性最高,为97%,与耧斗菜△8脂肪酸脱饱和酶基因相似性最低,为62%。     

农作物基因工程技术显露巨大潜力

所谓农作物的基因工程,是指通过改善作物的基因,使农作物具有抗病、耐热、高产等优质特性,以适应人类对作物日益增长的需要,保持农业的可持续发展。有人会问,农作物的基因改良与早前已被人们熟     

植物肉桂酰辅酶A还原酶基因的结构功能及应用潜力

木质素的合成途径非常复杂.肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是木质素合成特异途径的第1个关键酶.可催化3种羟基肉桂酸的辅酶A酯的还原反应.生成相应的肉桂醛.主要综述了肉桂酰辅酶A还原酶基因在木质素合成中的功能、基本结构方面的研究进展,并介绍了该基因在造纸林木改育、作物品质改良、植物抗病抗逆及生物质能等方面研究中的应用.     

樟叶越桔叶芽总RNA提取方法比较研究

本项实验采用改良CTAB、改良SDS、RNApure Plant Kit和Plant RNA Kit 4种方法提取樟叶越桔叶芽总RNA,以期获得适合于樟叶越桔叶芽高质量总RNA的最佳提取方法。总RNA纯度和完整性分别用紫外分光光度计法和琼脂糖凝胶电泳法检测。结果表明,采用改良CTAB和Plant RNA Kit法获得的RNA完整性好,纯度高,A260/A280值分别为2.07和2.08,28S和18S rRNA条带清晰,且前者的亮度约为后者的2倍,无弥散现象。将改良CTAB和Plant RNA Kit法获得的总RNA进行RT-PCR扩增,成功克隆获得了樟叶越桔花色苷5-芳香族酰基转移酶基因长316 bp的cDNA序列。证明改良CTAB和Plant RNA Kit法是樟叶越桔叶芽高质量总RNA的最适提取方法。     

杨树木材品质性状遗传变异的研究进展

概述了杨树木材解剖性质、物理力学性质和化学性质等木材品质性状的遗传变异研究动态,分析了影响杨树木材品质性状的主要因素,包括遗传因素和环境因素等方面。展望了杨树木材品质性状遗传变异研究的发展趋势,认为在杂交育种等传统材性遗传改良的基础上,通过基因工程、分子标记以及基因型和表型的联合选择等辅助育种手段,能够加速杨树木材品质遗传改良的进程。     

杉木叶片原生质体分离及RNA提取体系的建立

【目的】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木原生质体开展分子生物学研究提供技术支持,也可为其他林木原生质体的总RNA提取研究提供参考。【方法】选取杉木组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片为材料,通过分析5种不同酶组合、真空处理时间(0、5、10、15、20 min)、渗透压(0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L-1甘露醇)、BSA浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)及酶解时间(1、2、3、4、5 h)5个条件,进行杉木叶片原生质体的分离。采用改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、CTAB-Li Cl法、CTAB-Li Cl+10μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法、天根RNA提取试剂盒法共7种方法提取杉木原生质体RNA,通过杉木内参基因和2个特异基因进行RNA质量验证,比较不同方法的提取效果。【结果】在1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、0.5 mol·L-1甘露醇以及0.3%BSA的混合酶液中,真空处理10 min,酶解2 h,可分离出高活力的纯净杉木原生质体,其产量可达到7.27×106个·g-1,活力可达到94%。7种方法皆能提取出杉木叶片原生质体的总RNA,但不同方法间存在明显差异,其中改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、改良CTAB-Li Cl法、改良CTAB-Li Cl+10μg糖原法提取的RNA有不同程度的降解现象,其余方法所提取的RNA完整性较好,且OD260/280和OD260/230值均在1.8~2.0范围内;在RNA得率方面,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg,分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍;综合考虑,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法提取杉木原生质体RNA的效果最好。【结论】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分离条件为纤维素酶R-10浓度1.5%、离析酶R-10浓度1%、果胶酶Y-23浓度0.2%、甘露醇浓度0.5 mol·L-1、BSA浓度0.3%,真空处理10 min,酶解2 h,可大量获得高质量的杉木原生质体;利用改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法,可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg。研究结果为杉木重要性状关键基因的功能研究及其在育种中的应用提供了重要基础。     

山核桃花芽总RNA提取方法研究

以山核桃的花芽为材料,利用改良CTAB法、异硫氰酸胍法和改良热酚法提取其总RNA,并对RNA产率、纯度、电泳图谱和RT-PCR进行分析,结果表明:改良CTAB法明显优于其它两种提取方法,用它提取的28S rRNA、18S rRNA条带清晰、稳定,无降解,OD260/OD280值保持在1.9～2.0,产率相对较高;经RT-PCR检测发现,改良CTAB提取的RNA能被成花基因特异引物扩增出清晰的条带,说明该法完全适合于山核桃花芽总RNA的提取,并可用于Northern杂交、cDNA文库构建等分子生物学操作.     

国槐苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、反义表达载体构建及遗传转化

根据其它植物PAL基因的保守区域,设计一对兼并引物,采用RT-PCR方法从国槐中克隆了一个长866 bp的PAL基因片段,命名为SjPAL.序列分析发现SjPAL多肽与其它植物的PAL氨基酸序列高度同源(87%以上),且包含与水稻和拟南芥的PAL类似的活性位点.系统进化树分析表明SjPAL与豆科植物的PAL亲缘关系较近.RT-PCR结果显示,SjPAL在根和茎的表达量约为叶中的3倍.利用反义RNA技术将SjPAL基因克隆至植物表达载体pBI121,构建了SjPAL反义RNA植物表达载体pBI121-PAL,通过根癌农杆菌EHA105将其导入拟南芥基因组,对获得的抗性植株进行PCR鉴定、Northern杂交分析、PAL活性分析以及总多酚含量和类黄酮含量分析.结果表明,该反义RNA已整合到拟南芥基因组中,转基因拟南芥的PAL基因表达量、单位材料PAL活性、总多酚含量和类黄酮含量均显著低于野生型对照.本研究为下一步利用该基因反义表达载体转化国槐,通过调节酚类物质含量提高其在再生体系中的生根能力提供了试验依据.     

嫁接繁殖研究进展及其在林木遗传改良中的应用前景

嫁接作为一种传统的无性繁殖方法,已广泛应用于农林领域中的良种扩繁保存、品种改良、新品种选育等方面,它能够有效提高作物产量、抗逆性,改变植物的开花结果习性及改良果实品质。文中介绍了嫁接繁殖的特性,并从嫁接愈合解剖学、生理生化、分子机理3个方面对国内外有关嫁接成活机理进行了系统综述;探讨了嫁接引起的遗传变异及其在林木遗传改良中的应用前景,以期为嫁接技术改进及林木遗传改良提供新思路。     

中国杨树分子遗传改良的研究现状

杨树是中国广泛栽培的重要造林树种之一 ,我国是世界上杨树资源丰富的国家 .杨树具有速生丰产、实用性强、无性繁殖能力强 ,且基因组较小等特点 ,现已成为研究林木生理和基因工程研究的模式树种 .该文概述了基因工程技术、遗传图谱构建、重要性状基因定位以及分子标记辅助选择育种等方面在中国杨树遗传改良中的应用研究进展 ,并对现代分子生物学技术在林木遗传改良应用中存在的主要问题和应用前景进行了讨论     

RNA干扰技术与植物病毒病害防治

RNA干扰是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物中，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表迭mRNA的生物学功能。应用RNAi技术，将病毒在复制中起关键作用的基因作为目标，设计dsRNA导入植株培育抗病毒植株。