杉木叶片原生质体分离及RNA提取体系的建立

【目的】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木原生质体开展分子生物学研究提供技术支持,也可为其他林木原生质体的总RNA提取研究提供参考。【方法】选取杉木组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片为材料,通过分析5种不同酶组合、真空处理时间(0、5、10、15、20 min)、渗透压(0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L-1甘露醇)、BSA浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)及酶解时间(1、2、3、4、5 h)5个条件,进行杉木叶片原生质体的分离。采用改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、CTAB-Li Cl法、CTAB-Li Cl+10μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法、天根RNA提取试剂盒法共7种方法提取杉木原生质体RNA,通过杉木内参基因和2个特异基因进行RNA质量验证,比较不同方法的提取效果。【结果】在1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、0.5 mol·L-1甘露醇以及0.3%BSA的混合酶液中,真空处理10 min,酶解2 h,可分离出高活力的纯净杉木原生质体,其产量可达到7.27×106个·g-1,活力可达到94%。7种方法皆能提取出杉木叶片原生质体的总RNA,但不同方法间存在明显差异,其中改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、改良CTAB-Li Cl法、改良CTAB-Li Cl+10μg糖原法提取的RNA有不同程度的降解现象,其余方法所提取的RNA完整性较好,且OD260/280和OD260/230值均在1.8~2.0范围内;在RNA得率方面,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg,分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍;综合考虑,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法提取杉木原生质体RNA的效果最好。【结论】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分离条件为纤维素酶R-10浓度1.5%、离析酶R-10浓度1%、果胶酶Y-23浓度0.2%、甘露醇浓度0.5 mol·L-1、BSA浓度0.3%,真空处理10 min,酶解2 h,可大量获得高质量的杉木原生质体;利用改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法,可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg。研究结果为杉木重要性状关键基因的功能研究及其在育种中的应用提供了重要基础。     

地锦与五叶地锦原生质体分离及培养研究

用纤维素酶、果胶酶、甘露醇的混合酶液提取地锦和五叶地锦无菌苗幼叶、五叶地锦胚乳愈伤组织及地锦幼胚愈伤组织的原生质体,对影响原生质体提取得率及活力因素进行分析,对不同材料原生质体得率进行比较,对提取的原生质体进行液体浅层、固液结合及固体等方式培养,对原生质体形成的愈伤组织以MS和改良B5培养基附加不同浓度NAA、6-BA、2,4-D、PEG、KT、ZT等进行分化培养.试验结果表明纤维素酶对原生质体提取得率有极显著影响,适宜地锦幼叶原生质体提取的酶液组合为纤维素酶O.5%、果胶酶0.3%、甘露醇0.6 mol·L-1、酶解8 h;不同材料原生质体提取得率有显著差异;仅五叶地锦胚乳愈伤组织来源的原生质体在固体培养基中形成新的愈伤组织,其它方式培养的不同材料原生质体均无分裂或仅形成数十个细胞的细胞团后便解体;用30余组配方进行了五叶地锦胚乳愈伤组织原生质体形成的新愈伤组织的分化培养,继代6～10次后仍无分化迹象.     

枣树原生质体分离条件的研究

枣树原生质体分离研究是其原生质体培养与融合、外源遗传物质转化等研究的基础工作．用胚性悬浮培养细胞、细粒状胚性愈伤组织、未细切愈伤组织和已细切愈伤组织等４种材料进行原生质体分离．结果表明,枣树胚性悬浮培养细胞是最佳起始材料,用浓度为１０ｇ／Ｌ纤维素酶＋１ｇ／Ｌ离析酶＋ＣＰＷ盐（１３２０ｍｇ／ＬＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ和１００ｍｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ组成的混合液）＋０．７ｍｏｌ／Ｌ甘露醇组成的混合酶液对起始材料进行１６ｈ的酶解,可获得较高的原生质体产量,且原生质体活力较高．     

转基因741杨原生质体游离与纯化研究

以转双抗虫基因741杨无菌苗叶片为材料,对叶片原生质体游离、纯化方法及影响因素等进行了分析研究.结果表明,上部叶片产量和活力均高于其他叶位,在实验的浓度范围之内,Macerozyme R-10(离析酶)、Cellulase Onozuka R-10(纤维素酶)、Driselase (Sigma)(崩溃酶)对原生质体的产量和活力无显著影响.适宜转双抗虫基因741杨叶片原生质体游离与纯化的条件为无菌苗上部叶片为材料,0.7 mol/L甘露醇的CPW盐溶液预质壁分离1～1.5 h CPW+0.5％ Macerozyme R-10+0.25％ CellulaseOnozuka R-10+0.025％ Driselase (Sigma)+ 0.5 mol/L甘露醇(pH 5.7),酶解温度27℃,酶解时间10 h,用“过滤-离心-漂浮法”纯化原生质体.     

桉树原生质体分离体系建立研究初报

以雷林一号桉及尾叶桉为对象进行了原生质体分离体系建立研究,结果表明：雷林一号桉及尾叶桉胚性愈伤诱导的最适应培养基分别为：Ｂ５＋２,４－Ｄ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ０．８ｍｇ／Ｌ及Ｂ５＋２,４－Ｄ２．０ｍｇ／Ｌ。胚性愈伤继代培养基为：Ｂ５＋２,４－Ｄ０．５～１．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ０．５ｍｇ／Ｌ。黑暗下３～５天的预培养对愈伤组织上的褐化有明显的抑制作用。雷林一号桉及尾叶桉原生质体分离的最适酶液组合分别为：纤维素酶２％＋离析酶１％＋崩溃酶０．１％;纤维素酶２％＋离析酶１％＋崩溃酶０．０５％。愈伤组织在０．９ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中浸泡１ｈ,并于酶解后４ｈ更换一次酶液有利于原生质体产量与活力的提高。淡黄色松散愈伤组织原生质分离效果较其它质地的愈伤组织好。继代后８～１０天愈伤组织作原生质体的分离材料较其它年龄的愈伤组织合适。     

桉树原生质体制备及自制显微操纵器简介

将组培渡口赤桉芽丛的幼叶及嫩茎(全长3—4cm),投入含3％纤维素酶、0.5％果胶酶、0.5mol·L~(-1)甘露醇的溶液(pH5.5)中。在30—32℃水浴上,经24—36h酶解,其间不要剧烈震摇,然后以200目(US mesh)尼龙筛网粗滤去掉细胞残片,即可获得桉树原生质体。见照片1。经测定桉树幼叶原生质体的直径为0.0093mm左右。使用过的酶液经澄清,其上清液经400目筛网过滤后可再使用。     

不同酶解条件对金边瑞香幼叶原生质体分离的影响

以室内培养的金边瑞香浅黄绿色、质地幼嫩的叶片为材料,探讨了影响其原生质分离的因素。结果表明:对原生质分离效果影响最大的是纤维素酶浓度和酶解时间;采用纤维素酶质量分数为0.2%、甘露醇质量浓度为0.6 mol.L-1、酶解时间为10 h时原生质分离效果最好,原生质体的产量为2.2×105个.g-1。     

杨树炭疽病菌原生质体遗传转化的建立及绿色荧光蛋白的表达

以杨树炭疽病菌菌株C1-5-2作为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B(hph)和GFP表达基因的质粒gGFP转入杨树炭疽病菌菌丝的原生质体中。幼嫩菌丝在0.7mol·L-1NaCl溶解的1% Lysing enzyme酶解液的作用下酶解210min可以得到108·mL-1的原生质体;在PEG介导下,通过含有潮霉素浓度为300μg·mL-1的PDA选择培养基筛选转化子,每微克DNA获得41个转化子的平均转化效率。对转化子进行PCR鉴定表明:hph基因和GFP基因已经整合到杨树炭疽病菌转化子基因组中,通过荧光显微镜观察到转化子可以发出清晰的绿色荧光,且转化子的潮霉素抗性和GFP表达性状可以稳定遗传。     

人心果原生质体分离初探

以人心果幼嫩叶片组织为材料,研究了酶液组合、酶解时间、酶液中甘露醇含量、pH值、温度等因素对其原生质体分离的影响,结果表明:以3%纤维素酶R-10+0.4%果胶酶Y-23为混合酶液,0.6 mol.L-1甘露醇为渗透压稳定剂,pH 5.6的酶液组合,在28℃的黑暗条件下振荡,酶解时间2 h,分离出的原生质体产量最佳,可达到12.4×106个.g-1。     

The Study about Enzymatic Hydrolysis of Bagasse Sulfite Pulp and the Assistant Effect of Additives

以亚硫酸盐蔗渣浆为研究对象,研究了底物浓度、外源添加物种类和浓度对纤维素酶解工艺的影响以及PEG6000强化酶解效率的作用机理.研究结果表明,纤维素酶用量15 FPIU/g(以绝干纤维素计,下同)、β-葡萄糖苷酶用量30 CBU/g,纤维素质量浓度80 g/L条件下水解48 h,葡萄糖质量浓度达72.51 g/L,葡萄糖得率、纤维素酶解得率和总糖得率达81.58％、86.79％和84.23％.PEG6000可有效强化酶解,添加量为2g/L时,水解48 h葡萄糖质量浓度可升至78.54 g/L,葡萄糖得率、纤维素酶解得率和总糖得率达88.36％、95.02％和92.54％.添加2g/L的PEG6000使纤维素酶Celluclast 1.5 L滤纸酶活力提高到原酶活力的117.33％;同时50℃,pH值4.8,保温48 h,残余酶活力同比增加38.99％.     

亚硫酸盐蔗渣浆酶解工艺及外源物辅助作用的研究

以亚硫酸盐蔗渣浆为研究对象,研究了底物浓度、外源添加物种类和浓度对纤维素酶解工艺的影响以及PEG6000强化酶解效率的作用机理。研究结果表明,纤维素酶用量15 FPIU/g(以绝干纤维素计,下同)、β-葡萄糖苷酶用量30 CBU/g,纤维素质量浓度80 g/L条件下水解48 h,葡萄糖质量浓度达72.51 g/L,葡萄糖得率、纤维素酶解得率和总糖得率达81.58%、86.79%和84.23%。PEG6000可有效强化酶解,添加量为2 g/L时,水解48 h葡萄糖质量浓度可升至78.54 g/L,葡萄糖得率、纤维素酶解得率和总糖得率达88.36%、95.02%和92.54%。添加2 g/L的PEG6000使纤维素酶Celluclast1.5 L滤纸酶活力提高到原酶活力的117.33%;同时50℃,pH值4.8,保温48 h,残余酶活力同比增加38.99%。     

银杏原生质体制备及其融合研究

以银杏品种湖南梅核成熟胚进行组织培养得到的无菌苗和愈伤组织为材料,用不同酶液处理进行原生质体制备,并用PEG法进行原生质体融合实验。结果显示,以2.0%纤维素酶+1.0%果胶酶+5.0mmol/LMES+6mmol/LCacl2+0.6mol/L甘露醇( 号酶液)酶解银杏组织、方法1提取原生质体效果最好,其最高原生质体产率为9.4×107个/g;以17%蔗糖溶液处理得到原生质体质量最好。用40%PEG6000+0.3mol/L钙离子+pH9.5液体处理原生质混合液,银杏原生质体融合率最高,为67%。     

胡杨悬浮细胞原生质体游离及质膜单离子通道测定

该文以胡杨 (Populuseuphratica)悬浮细胞为材料 ,利用 1 0 %纤维素酶“onozuka”R 10、0 0 1%果胶酶Y 2 3、0 15 %离析酶R 10和 0 1%半纤维素酶的混合酶液消化细胞壁 ,得到原生质体 .并利用膜片钳细胞贴附技术分别测到质膜内向和外向单通道电流 .通道电流在不同水平上变化 ,表明并非只有一种类型的通道开放 .树木细胞原生质体的分离以及利用膜片钳测定细胞质膜离子通道的成功实践为深入研究木本植物抗盐的细胞学机制奠定了基础     

朱红栓菌原生质体制备与再生的研究

将2016年7月在黑龙江省凉水国家级自然保护区采集的朱红栓菌Trametes cinnabarina子实体接种于PDA固体培养基平皿中,30℃下培养7 d,截取菌丝体接种于液体培养基中用于原生质体制备与再生实验。通过单因素试验和正交试验,研究酶解温度、酶解时间、菌丝质量分数、酶配比对原生质体制备的影响。结果表明,以0.6 mol·L-1甘露醇溶液作为高渗缓冲液,复合酶组成为1.5%溶壁酶﹢1.0%纤维素酶﹢1.0%蜗牛酶,菌丝质量分数为20%,30℃条件下酶解3.5 h为朱红栓菌原生质体制备的最适条件,产量达1.00×107个·m L-1;以0.6 mol·L-1蔗糖溶液作为再生高渗缓冲液,原生质体再生率最高达20.6%。     

外源添加物强化中温碱抽提玉米秸秆渣酶解过程的研究

以中温碱抽提玉米秸秆渣为研究对象,考察了不同外源添加物对酶解工艺的辅助作用和影响机制。研究结果表明,采用中温碱抽提玉米秸秆可以脱除50.02%木质素,添加PEG6000辅助水解作用明显。当纤维素底物质量浓度40 g/L,酶用量在纤维素酶(Celluclast 1.5 L)15 FPIU/g和纤维二糖酶(Novozyme 188)30 BU/g水解48 h,添加PEG6000 4.0 g/L葡萄糖得率73.51%,酶解率84.51%,较未添加样品上升幅度分别达到26.2%和27.1%。添加PEG不仅可以减轻酶蛋白和碱抽提玉米秸秆渣的吸附,提高酶在液相中的分配,对纤维素酶活力和稳定性也具有显著的促进作用。PEG存在下纤维素酶1.5 L的滤纸酶活提高34.1%,稳定性提高57.3%。     

山地杨MD-110原生质体的分离技术

山地杨MD-110(P.maximowiczii×P.deltoides)是黑杨派与青杨派的优良杂交品种.选择生长约1个月无菌苗的健壮叶片(长1.5～2 cm),切成长约0.5 mm的细条,在2%纤维素酶RS、0.05%果胶酶Y-23、0.6 M甘露醇(pH=5.6)组成的酶液进行分离,分离出大量的具有活力的原生质体,且大小均匀,细胞膜完整;酶解2 h后轻轻摇动培养皿利于酶解,酶解时间以6 h为宜.纯化后其原生质体的产量为3.6×107/gfr.wt,活力可达90%以上.纯化后的原生质体在B5(2倍浓度)培养基,附加2,4-D 10 nag·L-1、NAA 0.2 mg·L-1和BAP 1 mg·L-1中进行高密度液体浅层培养.     

狭叶薰衣草愈伤组织诱导及原生质体分离研究

探究薰衣草愈伤组织诱导及原生质体分离的最适条件,为薰衣草品种优化和育种工作提供基础数据和理论依据。以薰衣草幼嫩叶片为原材料,采用化学诱导方法诱导薰衣草脱分化形成愈伤组织,利用酶解法促使原生质体游离;结合染色排除法计算原生质体活力。实验结果表明,当MS培养基中加入2,4-D(1.8mg/L)和6-BA(0.5mg/L)时,薰衣草的出愈率最高,可达88%;愈伤组织在纤维素酶和果胶酶的含量分别为1.8%、0.5%的条件下,酶解原生质体的产量最高,可达1.180×10~5个/g,原生质体活力最高,可达78.05%。本实验获得的高效愈伤组织诱导条件,为后续愈伤组织再生体系研究提供资料支持。建立了原生质体分离体系,稳定的获得了高产量、高活力的原生质体。     

小黑杨转抗真菌病基因的初步研究

以小黑杨为受体材料,在对传统的农杆菌介导的叶盘转化法改进的基础上进行了转化外源几丁质酶基因。试验表明,菌液浓度为0.3~0.4是小黑杨遗传转化的适宜浓度,0.3时分化率最高(24.75),菌液浓度超过0.45时,分化率逐渐下降。经过对转化子的PCR及PCR-Sothern鉴定,结果呈阳性,证明外源几丁质酶基因导入并整合进小黑杨基因组中。     

马尾松PmPIN1基因的克隆及功能分析

【目的】PIN1基因通过调控生长素极性运输的方式在植物根系生长发育中发挥作用。对马尾松PmPIN1基因进行全长克隆和功能分析,有助于在分子水平揭示马尾松的生根机制。【方法】运用PCR和RACE技术成功克隆马尾松PmPIN1基因cDNA序列;利用生物信息学软件分析PmPIN1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;通过实时荧光定量分析PmPIN1基因在10年生马尾松幼根、1年生枝条、新叶、花中的表达量差异;利用农杆菌侵染法将PmPIN1基因转入烟草获得转基因植株,比较转基因烟草与转pCAMBIA-1302空白载体烟草之间的表型差异;用激光共聚焦显微镜观察PmPIN1-GFP荧光蛋白在转基因烟草根中的表达模式;酶联免疫法测定野生型和转基因烟草的根、根茎结合处及叶中的生长素含量;用不同浓度的生长素极性运输抑制剂1-N-萘基邻氨甲酰苯甲酸(NPA)处理野生型与转基因烟草,分析烟草根、根茎结合处、叶中的生长素含量变化;利用PEG介导法将16318-hGFP-PmPIN1重组载体转化至拟南芥原生质体中进行亚细胞定位分析。【结果】PmPIN1基因全长2914bp,包含2085bp的ORF,编码的蛋白由695个氨基酸组成,N端与C端均有膜运输蛋白。系统进化树显示马尾松与油松在发育树同一支上。通过实时荧光定量发现PmPIN1在不同组织中的表达量差异达到极显著,1年生枝条与幼根中表达量较高,花中最低。农杆菌介导法转化烟草获得的转基因烟草,较转空载烟草株高增长,生根量增加且根系变长。激光共聚焦显微镜观察得出转基因烟草根部中间有明显绿色荧光富集现象。酶联免疫法测定结果表明转基因烟草根、根茎结合处生长素含量高于野生型,且叶较根和根茎结合处减少。不同浓度NPA处理后,野生型烟草根中生长素含量变化达极显著,且生长素含量随NPA处理浓度的增加而减少;处理浓度为10nmol·L~(-1)时,叶中生长素含量最高;处理浓度为2nmol·L~(-1)时,根茎结合处生长素含量增加较多。不同浓度NPA处理后,转基因烟草不同部位生长素含量变化均未达到极显著。亚细胞定位分析表明PmPIN1蛋白主要分布于细胞膜上。【结论】马尾松PmPIN1与油松PIN1亲缘关系最近。PmPIN1属于膜蛋白。PmPIN1转基因烟草可能提高生长素由地上部位向地下部位的运输能力,减少NPA对生长素含量变化的影响,表明PmPIN1可能调控生长素的极性运输;PmPIN1-GFP绿色荧光富集在根部中间部位,PmPIN1在幼根中表达量较高,转基因烟草较转空载植株发根量多,根长长。研究结果表明PmPIN1基因可能在根系发育中发挥重要作用。     

光合色素含量差异对花叶唐竹不同叶色表型光合特性的影响

【目的】研究光合色素含量差异对花叶唐竹4种叶色表型光合特性的影响,为花叶竹类的栽培和选育提供参考。【方法】以花叶唐竹2年生分株苗为研究对象,测定全绿、绿底白纹、白底绿纹、全白4种表型叶片的光合色素含量、光合生理参数及叶绿素荧光参数,分别观察绿色叶肉细胞和白色叶肉细胞的超微结构。【结果】4种表型间叶片光合色素含量差异显著,且随着叶片绿色面积比例的下降而呈现显著下降趋势;花叶唐竹绿色叶肉细胞的细胞器排列紧凑且十分完整,叶绿体发育健全,膜系统完善;在大多数白色叶肉细胞中,没有发现完整的叶绿体,而是发育不良的叶绿体和白色体; 4种表型叶片的叶绿素含量与其净光合速率、气孔导度、蒸腾速率及水分利用率呈正相关,与胞间二氧化碳浓度呈负相关;全白叶片由于缺乏PSⅡ光反应中心,原初光能转化能力低下,且无法进行光抑制的一系列自我保护反应。【结论】花叶唐竹白色叶肉细胞中叶绿体发育缺陷导致其叶绿素合成受阻,进而影响光合能力,使其净光合速率全为负值,且其自我保护机制较差,强光下易被灼伤,故需要予以适当遮荫。