抗松材线虫病马尾松种源化学成分与抗性机理研究（第Ⅲ报）——接种松材线虫引起抗性马尾松种源中性萜类含量变化关系的研究

通过气相色谱分析研究了高抗、中抗和敏感马尾松种源在接种松材线虫（PWN）后所引起的中性萜类（主要是倍半萜类）组分含量变化规律以及含量变化与种源抗性间相关性变化规律。结果表明，接种PWN使抗性马尾松种源中某些萜类组分如长叶烯等增多，而某些组分如反式石竹烯等减少；接种PWN使高抗种源中长叶烯与反式石竹烯含量比值先减小后增大，且超过接种前的水平，但是未改变种源的抗病特征；树木生长过程对种源抗性及本研究没有造成影响和干扰。     

抗松材线虫病马尾松种源化学成分与抗性机理研究(第Ⅲ报)——接种松材线虫引起抗性马尾松种源中性萜类含量变化关系的研究

通过气相色谱分析研究了高抗、中抗和敏感马尾松种源在接种松材线虫（PWN）后所引起的中性萜类（主要是倍半萜类）组分含量变化规律以及含量变化与种源抗性间相关性变化规律。结果表明，接种PWN使抗性马尾松种源中某些萜类组分如长叶烯等增多，而某些组分如反式石竹烯等减少；接种PWN使高抗种源中长叶烯与反式石竹烯含量比值先减小后增大，且超过接种前的水平，但是未改变种源的抗病特征；树木生长过程对种源抗性及本研究没有造成影响和干扰。     

砧木及抗性马尾松松脂组分对松材线虫的响应

目的 通过对马尾松接种松材线虫,分析接种前后松脂化学组分的变化,为马尾松抗松材线虫病的研究提供理论基础。 方法 以浙江省临海市5年生马尾松无性系为研究对象,提取接种前和接种松材线虫1、7、15 d的不同砧木（马尾松砧木和湿地松砧木）、不同抗性（高抗和易感）马尾松的松脂组分,分析各松脂组分含量及动态变化;利用松脂内所得有效萜类对松材线虫实施外源处理,测定松材线虫存活率。 结果 从不同砧木（马尾松砧木和湿地松砧木）、不同抗性（高抗和易感）马尾松中检出19种主要化学组分,其中,α-蒎烯、β-蒎烯、水芹烯、海松酸、山达海松酸、长叶松酸/左旋海松酸、去氢枞酸、枞酸和新枞酸含量较高。接种松材线虫1 d时马尾松砧木中β-月桂烯含量显著高于湿地松砧木（p<0.05）;接种松材线虫7 d与15 d时上述组分含量在不同砧木间无显著差异。不同抗性马尾松中α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、龙脑、长叶烯、α-石竹烯、反式-β-金合欢烯和新枞酸含量在接种松材线虫后变化规律不同,接种松材线虫1 d时高抗马尾松中α-蒎烯和β-蒎烯含量显著高于易感马尾松;接种松材线虫7 d时高抗马尾松中α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯和长叶烯含量显著高于易感马尾松（p<0.05）;接种松材线虫15 d时高抗马尾松中α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯和长叶烯含量显著高于易感马尾松（p<0.05）。对上述萜类组分进行梯度浓度松材线虫外源试验：以150 mg·g−1浓度α-蒎烯溶液处理0.5 h时,松材线虫存活率达20%;不同浓度β-蒎烯溶液对松材线虫抑制作用相同,1.20 mg·g−1浓度处理0.5 h时松材线虫存活率达50%左右;以10 mg·g−1浓度柠檬烯溶液处理0.5 h时,松材线虫存活率趋于零;以10 mg·g−1浓度长叶烯溶液处理0.5 h时,松材线虫存活率达18%。 结论 不同砧木对马尾松抗性无明显作用;接种松材线虫后,α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯和长叶烯含量存在显著差异,且均为高抗马尾松显著高于易感马尾松。α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯和长叶烯低浓度下抑制松材线虫活性,与马尾松抗性有关。     

松材线虫病抗性马尾松苗木的选育

营建现地测定林在松材线虫抗性育种过程中是一项非常重要的部分,分析测定林的生长特性及受害情况能够指导抗性种子园的改良.阐述了采种母树、播种育苗、人工接种测定、测定苗木选拔以及营建测定林.经二次测定后的苗木抗性水平均超过火炬松,4 a生树高年生长量为56 cm,根径、胸高直径等均优于普通马尾松,目前没有出现枯死个体.     

松材线虫自然侵染对黑松、马尾松针叶含水量、色素及抗氧化酶活性的影响

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是国际上公认的重要检疫性有害生物,其引起的松材线虫病是一种毁灭性森林病害。该病自20世纪初在日本首次发现以来,已从北美扩散蔓延至亚洲、欧洲等多个国家,造成大批松树死亡(Fielding et al.,1996)。     

松属树种对松材线虫的抗性

本文就国外开展的松属种类对松材线虫抗性的研究结果作一简介,以供我国的造林及培育抗性品种工作参考。     

松材线虫致病性最佳接种量的研究

松材线虫是引起松树死亡的一种毁灭性病害的病原。为了研究松材线虫的致病性,该文对松材线虫的接种量进行研究,对3年生黑松苗接种松材线虫后的发病程度进行了等级划分以及发病等级的描述。3年生黑松苗,接种松材线虫LN001后,每株接种量为10000条时,发病率、感病指数、死亡率3个指标均达到最大值。接种松材线虫LN002后,每株接种量为8000条的松苗,在接种第47d时,感病指数达到100。3年生黑松苗接种松材线虫8000~10000条,为适合进行松材线虫接种试验的接种量。     

接种用松材线虫分离种群的筛选

自2001年10月以来开展了“马尾松松材线虫抗性育种技术的开发”的项目工作，为选拔马尾松松材线虫抗性候补树，确保接种用的松材线虫虫源，对松材线虫分离种群的繁殖、致病力和增殖能力作了研究。对不同地区采取由松材线虫致死的19棵当年枯死木样品，用贝曼漏斗法从中分离出19个松材线虫分离种群，在25℃条件下，成功培养16个分离种群。在2a生黑松苗上进行接种，测定松材线虫的致病力。55d后在野外试验区的感病率为26．1％～97．6％，大棚试验区的感病率为84．4％～100％，野外与大棚内的加权平均感病率差20％以上，显示出松材线虫致病力由气温增高和土壤干燥而增强。分别对16个分离种群以相同的接种头数在PDA培养，其繁殖面积的快慢不同；以大量繁殖为目的，在同量的小麦培养基中以相同的接种量，各自的繁殖量也不同，每培养皿的繁殖量为98万～176万头。根据试验结果，选用致病力最强、繁殖力较强的广朱3B松材线虫分离种群作为接种用松材线虫的接种虫源。     

几种物质对松材线虫的作用

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害。本文选用了几种物质，采用浸泡生测法和棉球生测法测定了其对松材线虫的作用。结果表明，阿维菌素对松材线虫的杀线活性较强，米乐尔次之，狼牙刺种子粗提物和氯化铵的杀线活性均较弱，氯化钙则无杀线活性。阿维菌素和米乐尔对松材线虫繁殖均有较强的抑制作用，狼牙刺种子粗提物的抑制作用较弱，氯化铵无抑制作用，而氯化钙对松材线虫的繁殖具有促进作用。     

不同松树感染松材线虫后NO和核酸酶变化与其抗病性的关系

以黑松、马尾松和火炬松为研究对象,对其接种松材线虫后4,12,24,48,72,96和120 h的NO和核酸酶的活性进行测定.3种松树接种松材线虫后,针叶内NO平均含量的积累为火炬松＜马尾松＜黑松,这种差异在12 ～48 h尤为明显;48h后较其割伤处理(CK1)的增加幅度为火炬松＞马尾松＞黑松.同时3种松树接种后的核酸酶变化趋势存在差异,单链核酸酶活性在4～48 h为火炬松＞马尾松＞黑松,而火炬松双链核酸酶活性在4～96h时却一直低于马尾松和黑松,这表明不同松树体内单链或双链核酸酶的活性变化与其抗病性有关.且3种松树在接种松材线虫后,表现出症状的时间顺序为黑松最早,马尾松次之,火炬松最晚.这表明NO和核酸酶的变化与松树感染松材线虫后的病程发展密切相关.     

松材线虫携带细菌产生抑制真菌的物质

研究发现松材线虫携带的两株荧光假单胞菌GcM5-1A、ZM4A和恶臭假单胞菌ZpB1-2A具有抑制真菌菌丝生长的作用.首先对供试的8个细菌菌株进行抑菌活性生物测定,从中筛选出3个具有抑菌活性的细菌菌株;接着对细菌培养液及滤液、死细菌及活细菌进行生物测定;最后对细菌代谢物的性质进行生物测定.实验证明抑制真菌菌丝生长的活性成分为松材线虫携带细菌的挥发性代谢产物.     

松材线虫侵染下马尾松针叶miRNA和mRNA的关联表达

[目的]微小RNA(microRNA,miRNA)具有靶向沉默信使RNA(mRNA)表达的功能,是基因表达的负调控因子;研究并明确马尾松在遭受松材线虫侵染下是否存类似的调控模式,对于未来探析寄主植物对病原侵染胁迫下的应激机制及获得调控马尾松抗松材线虫病的miRNA及其靶标mRNA都具有重要意义。[方法]以前期高通量测序获得的松材线虫侵染1、2、3 d的马尾松针叶mRNA和miRNA表达谱为研究对象,采用STEM软件分别分析mRNA和miRNA的表达变化模式,并运用斯皮尔曼等级相关法研究松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA与mRNA的表达关联情况。[结果]松材线虫侵染下的马尾松针叶中的miRNA呈2种显著的表达变化模式,mRNA呈8种显著的表达变化模式,且15个miRNA与其12个靶标mRNA的表达变化模式相反,符合miRNA对靶标mRNA的负调控特点,这些靶标mRNA编码具有识别病原作用的ACRE、CC-NBS-LRR基因等。[结论]松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA及mRNA均呈多种表达变化模式,且部分miRNA与靶标mRNA的表达变化模式相反,推测其中部分miRNA可能是病原识别基因的负调控因子。     

不同真菌对松材线虫繁殖的影响

本文从四川某地木材样品上分离得到松材线虫,并利用板栗疫病菌、枯斑盘多毛孢、绿色交链孢、腐皮镰刀菌这四种来源不同的真菌进行繁殖.结果表明:松材线虫在板栗疫病菌中繁殖倍数最高可达406倍(一皿d=9cm);在枯斑盘多毛孢中,松材线虫最高可增殖322倍;而松材线虫在绿色交链孢中最高可增殖50.4倍;腐皮镰刀菌中松材线虫增殖倍数仅为11.2.实验同时表明,松材线虫对菌丝年龄有选择性.     

松材线虫和拟松材线虫不同株系致病性的研究*

１９９０－１９９３年，从国内外收集的松材线虫９个株系和拟松材线虫５个株系，用皮接法接种３－６年生的松苗，测定线虫的致病性。结果表明，松材线虫的致病力明显高于拟松材线虫，其中国内的５个株系致病力最高，拟松林线虫通常不致病或致病力极低，在同一线虫种内，株系间致病力随寄主不同而不同。在寄主死亡速度上，寄主相同并死亡率相同或相近时，采自南京、广东马尾松病树上的线虫株系接种后，寄主平均死亡时间略短于其它株系     

乙酰胆碱干预物质对松材线虫运动行为的影响

作者通过药物干预方式研究神经递质乙酰胆碱对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus运动行为的影响。结果表明:硫酸阿托品引起松材线虫泳动变缓,头部摆动频率和身体弯曲频率下降,随处理时间延长持续降低;运动形态出现由正常的S形变化为多节弯曲和螺旋状卷曲等异常状况;甲硫酸新斯的明引起头部摆动频率和身体弯曲频率提高、运动幅度加大等特征,同时也表现出明显的运动兴奋间歇性、短暂性及不规则扭动等特征。可见,干扰乙酰胆碱会导致松材线虫运动行为出现异常,并呈现规律性特征。     

不同生长调节剂配方对抗松材线虫病马尾松扦插生根的影响

以抗松材线虫病马尾松为研究对象,通过扦插繁殖试验,探索了生根粉1号(ABT1)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、多效唑(PBZ)5种植物生长调节物质在18种不同配比处理下对马尾松插穗生根率、内源生长素(IAA)与赤霉素(GAs)水平及扦插生根苗生长表现的差异。结果表明：马尾松扦插生根必须使用生长调节剂,供试的18种组合的生长调节剂中,以100 mg·L^-1 NAA+100 mg·L^-1 IAA+100 mg·L^-1 IBA+50 mg·L^-1 PBZ组合处理下马尾松的生根率最高,达95.3%。与未使用生长调节剂处理的穗条相比,该处理穗条在生根过程中内源性IAA水平较高,而GAs水平较低,且生根苗的根条数、生根时间、移栽成活率、苗高及生长活力等均表现较优。     

室温变化与松材线虫分离量的关系

通过室温变化对贝尔曼漏斗法分离松材线虫Bursaphelenchs xylophilus效果影响的分析,认为室温是影响线虫分离量的主要因素,二者呈正相关关系,以平均室温与线虫分离量的相关性最好,其回归方程式为Y=-19.49+29.51X。     

松材线虫和拟松材线虫不同株系酶电泳的研究*

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对来自国内及日本、加拿大、法国、挪威的松材线虫及拟松材线虫株系作酶电泳的初步分析。结果表明，不同株系的苹果酸脱氢酶及纤维素酶酶谱各不相同。超氧化物歧化酶有１条在不同株系中迁移率相同的酶带。松材线虫与拟松材线虫在酯酶谱上差异明显，但培养于裂褶菌、多毛孢和葡萄孢上的来自南京黑松上的同一株系线虫的酯酶谱也显示了明显差异，表明了该酶的不稳定性。谷氨酸草酰乙酸转氨酶是唯一可区分两种线虫的酶，松材线虫只有１条迁移率０．３９的带，拟松材线虫只有１条迁移率０．５１的带，可用于两种线虫的生化鉴定。对可溶性蛋白质及过氧化物酶的分析，未检测到清晰可辨的酶带。