病毒诱导的基因沉默（VIGS）研究进展

病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）是一种RNA 介导的植物抗病毒机制,近年来已被用作研究植物基因功能的反向遗传学手段。与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比,VIGS 技术研究周期短,不需要遗传转化,具有低成本、高通量等优势。因此,VIGS已被广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等生理途径相关基因的功能鉴定。综述了VIGS 的机制、技术发展、沉默效率的影响因素及其在植物基因功能鉴定中的应用,并对VIGS 在植物性状改良及植物保护方面的应用前景进行了展望。     

病毒诱导的基因沉默在植物中的应用现状

传统的病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)是一种小干扰RNA(Small interfering RNAs,siRNA)介导的RNA沉默技术(SIR VIGS),作为一种有效的反向遗传学技术广泛的用于植物基因组功能的鉴定。另外,VIGS技术开始用来研究植物内源miRNA(microRNA)的功能,这为miRNA的功能研究提供了快速有效的方法。随着基因沉默技术的应用和改进,将会有越来越多的植物基因组功能得到快速有效的验证。     

白菜病毒诱导基因沉默技术体系的建立

 以白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）品种‘苏州青’为材料,利用芜菁黄化花叶病毒（Turnip yellow mosaic virus,TYMV）质粒pTY成功抑制了白菜叶片八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase,PDS）基因的表达,验证了病毒载体pTY在白菜上诱导基因沉默的能力,建立了白菜病毒诱导基因沉默VIGS体系。为了进一步验证病毒载体pTY在白菜上诱导基因沉默的能力,以BcNRT1为靶基因,构建pTY-BcNRT1质粒侵染白菜后,显著抑制了BcNRT1在转录水平的表达。     

ⅥGS技术在观赏植物中应用的研究进展

病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术,具有周期短、成本低、不需要转化遗传、高通量等优势,而被广泛地应用于探究植物生长发育、抗病及生理代谢等相关基因功能的鉴定.观赏植物具有较高的经济效益,VIGS技术在观赏植物中的应用具有良好的前景.现通过综述VIGS技术的建立与发展、作用机制及在观赏植物基因功能鉴定的应用实例,探讨该技术应用于观赏植物中影响沉默效率的因素;并展望其在观赏植物保护、丰富观赏性状的分子育种领域方面的应用前景.     

病毒诱导的基因沉默在番茄功能基因组学研究中的应用进展

对近年来病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术在番茄果实发育、激素调控、植物-病原物互作、防御害虫及非生物胁迫应答相关基因功能研究方面的进展进行了综述。     

查尔酮合酶基因对桃果实花色苷代谢的影响

从桃（Prunus persica）果皮中克隆了493 bp的查耳酮合酶（Chalcone Synthase,CHS）基因片段,利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）构建干扰载体TRV-LIC-CHSi,通过农杆菌渗入法沉默目的基因CHS的表达,从而研究CHS在桃果实花色苷代谢途径中的功能。干扰CHS基因的表达后,CHS的表达量降低88.8%,果皮中花青素糖苷含量下降87%,槲皮素糖苷含量下降35%,绿原酸含量升高57%,原花青素含量、儿茶素含量和山奈酚糖苷含量无显著变化。研究结果表明,沉默CHS基因,会使整个花色苷代谢途径转向绿原酸及其复合物方向。CHS基因调控着类黄酮类物质的代谢方向,是花色苷代谢途径中的重要基因。     

番茄microRNA基因沉默载体的构建方法

该试验提出了一种简单且快速构建番茄中人工miRNA表达载体的方法,以包含miR319a前体骨架的质粒pRS300为模板,以重叠PCR技术来扩增miR1917的前体。miR1917的靶基因是LeCTR1,是乙烯反应中的一种负调控因子。含有miR1917的重组前体成功地转化到表达载体pGreen0029-35s中,通过植物根癌农杆菌C58介导的叶盘法成功获得了转基因植株。此种方法可为番茄中miRNA的作用机理研究提供一定的理论基础。     

番茄Cf-4-Avr4互作系统中信号转导基因的克隆与功能分析

 通过基因序列分析从抗叶霉病的番茄(含Cf-4基因) 中筛选出1个参与植物过敏反应的基因RGL (Resistance Gene L ike) 。采用酵母双杂交方法, 从番茄cDNA文库中筛选出两个与该基因的编码蛋白发生互作的蛋白, 分别命名为RGLIP-1和RGLIP-2 (RGL Interacting Protein) 。RGLIP-1全长291个氨基酸, 与类囊体内腔蛋白同源性较高, RGLIP-2全长248个氨基酸, 与拟南芥转导素高度同源。利用病毒诱导的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing, VIGS) 技术进行了基因功能分析。结果表明, 这两个互作蛋白参与了与植物抗病相关的过敏反应(Hypersensitive Response, HR) 。     

番茄中维生素E合成相关基因的VIGS载体构建及侵染

以番茄为材料,采用RT-PCR技术从番茄果实中克隆了其体内维生素E合成相关基因—生育酚环化酶(Tocopherol cyclase VTE1)的部分序列,片段长420 bp,序列分析表明,该基因片段与番茄中生育酚环化酶cDNA序列同源性为95％,然后通过XhoⅠ、KpnⅠ 2个酶切位点连接VTE1片段和含PDS的pTRV2质粒,获得了重组载体pTRV2- PDS-VTE1,将该重组载体转化农杆菌GV3101,并侵染番茄.该研究为下一步分析基因沉默后的番茄中维生素E含量的变化提供试验材料;为今后通过转基因技术调节番茄果实的维生素E的合成奠定了基础.     

VIGS载体在果树中的应用研究进展

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物中天然存在的一种抵御外源核酸入侵的防御反应,属于转录后基因沉默现象,现在已被开发成通过改造含有目的基因片段的病毒载体来抑制植物内源基因表达的遗传技术。与传统的植物转基因技术相比,VIGS技术具有简便、高效、高通量的优势,近年来在果树基因功能的研究中发挥了重要作用。由于VIGS技术需要借助病毒载体来实现,所以选择适宜的病毒载体是在性状各异的果树中成功构建VIGS体系的关键。本文介绍了在果树中应用的VIGS载体及其在基因功能研究中的应用实例,并分析了病毒载体在诱导果树基因沉默时存在的一些问题及解决方法。     

茄子TRV-VIGS体系的优化及SmIAA19基因功能初步分析

以经过改造的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体PYL156为工具,采用叶片注射法侵染茄子（Solanum melongena L.）叶片,通过表型比较、TRV病毒分子检测和荧光定量PCR技术分析,探究环境温度、植株大小、目的基因插入片段大小对茄子TRV-VIGS沉默体系的影响。结果表明,昼夜温度为（25 ± 3）℃和（20 ± 2）℃时,接种茄子幼苗子叶的植株沉默效果明显,侵染后植株叶片中目的基因表达量与阴性对照相比明显降低;早春日光温室和秋季日光温室条件下,侵染植株表型性状和基因表达量差异不显著。沉默片段大小为200 bp左右时目的基因的沉默效果最好;侵染茄子幼苗子叶期植株出现明显病毒斑,而接种6周龄真叶则无明显表型差异。用茄子生长素诱导基因（SmIAA19）为靶基因对其进行验证,结果表明显著抑制了SmIAA19的表达,其在叶片中的表达量和生长素含量均显著降低,表明SmIAA19是1个与生长素代谢途径相关的基因。     

番茄抗叶霉病基因Cf19的抗性特点及遗传连锁分析

番茄抗叶霉病基因Cf19的抗性范围基本涵盖了中国目前分化出的所有叶霉菌生理小种,且抗性显著;台盼蓝染色结果显示该基因介导的抗性应答中出现明显的超敏反应,强度介于Cf4和Cf9基因之间;遗传连锁分析说明该基因的遗传特性符合单基因显性遗传规律;通过进一步SSR和AFLP分子标记连锁分析,共找到6个与Cf19基因连锁的分子标记,并将该基因初步定位于番茄1号染色体短臂区域。     

矮牵牛PDS基因的克隆及其在shRNA介导的基因沉默中的应用

以矮牵牛(Petunia hybrida)自交系‘Mitchell Diploid’(MD)为材料,通过3′RACE和5′RACE获得了其八氢番茄红素脱氢酶基因(PhPDS)的cDNA序列,进而通过PCR扩增出编码区的基因组序列。分析结果显示,PhPDS的cDNA序列全长2 182 bp,编码区序列1 746 bp,编码582个氨基酸。推测的蛋白质序列具有类胡萝卜素脱氢酶的保守结构域特征。编码区的基因组序列长7 609 bp,结构与番茄和拟南芥等PDS基因相似,具有14个外显子和13个内含子。利用博德研究所的小发夹RNA(shRNA)设计程序设计了两个针对PhPDS的shRNA,构建植物表达载体转化矮牵牛后,从其中一个载体的转化子中获得白色愈伤组织和幼枝,对白色幼枝的RT-PCR检测表明,其PDS基因的cDNA累积量减少,表明shRNA基因沉默技术能在矮牵牛中应用。以PDS基因为靶基因比用花色素合成基因研究基因沉默技术能更快地分析基因沉默的效果,全长序列的获得将有助于PDS基因在矮牵牛基因沉默技术研究中的应用。     

番茄抗黄化曲叶病基因y-5分子标记及遗传分析

以番茄抗黄化曲叶病毒ty-5基因的抗病材料‘13072’（亚洲蔬菜研究与发展中心提供）和感病材料‘13493’（早粉2号）为亲本配置杂交组合,获得F1、F2、BC1P1和BC1P2 4个世代,对番茄黄化曲叶病抗性基因ty-5进行遗传规律分析和基因定位研究。结果表明,抗性基因ty-5为隐性基因控制。利用657株F2分离单株,应用群体分离分析（BSA）法筛选得到与ty-5基因连锁的5个多态性SSR标记,构建了ty-5基因的分子标记连锁图谱,将ty-5基因定位到番茄4号染色体上,物理距离为737 kb的区段内,两侧翼标记为TES2461和TGS4151,与ty-5遗传距离分别为2.4 cM和3.1 cM。生物信息学分析表明,该区段存在52个预测候选基因。