鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至 7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含"GC"碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至+7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含“GC“碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

矮牵牛 F3′5′H基因的克隆及其在不同着色花药中的表达

通过品种间杂交和后代筛选,从模式植物矮牵牛中筛选出具有蓝花冠蓝花药的稳定株系。为了明确蓝色花药形成的分子机制,对蓝色花色素苷合成途径中的关键酶黄烷酮3′,5′-羟化酶(F3′5′H)进行研究,比较不同花药着色的矮牵牛植株中,F3′5′H基因组DNA的PCR扩增模式、基因组序列,以及花发育第3阶段的花药组织中基因表达差异。结果表明,蓝色花药植株与对照材料间的F3′5′H基因组DNA扩增模式基本相同,都存在两个基因编码位点Hf1和Hf2。在蓝色花药植株中,Hf1位点扩增出两个片段,一个与已公布的Hf1的序列完全一致,另一个是不能编码完整蛋白的假基因;Hf2基因位点也扩增出两个基因片段,其中有一个片段的5′-末端序列与已公布的Hf2序列有96%同源性,另一个是非特异性扩增产物。此外,Hf1基因可以在花药组织中表达,但仅在蓝色花药中有转录,而Hf2基因在花药组织中没有表达。根据上述结果认为,矮牵牛植株中,编码F3′5′H的Hf1基因与蓝色花药的形成相关,这一结论为进一步揭示矮牵牛蓝色花药形成的分子机制奠定了基础。     

矮牵牛花特异表达启动子PchsA的克隆及蓝色基因F3′5′H表达载体的构建

[目的]克隆花特异表达启动子PchsA,将此启动子与蓝色基因“F3′5′H”构建新的表达载体,拟以该启动子驱动“F3′5′H”在其他花色中特异表达。[方法]根据GenBank报道的矮牵牛启动子的序列设计并合成一对特异引物,以蓝紫色矮牵牛总DNA为模板,用PCR仪扩增目的片段。[结果]PCR扩增出的启动子DNA片段长约550bp,回收后连接到PGM-T质粒载体上,经转化、筛选确定重组子,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序,得到片段长度为553bp。经DNAMAN软件分析和GenBank上BLAST序列比对,显示序列与已报道序列同源性为98．55％。应用pcgene软件进行序列分析,结果表明试验克隆的启动子含有启动子所必须的所有调控元件,这与报道的序列基本一致。[结论]试验成功地克隆了CHSA启动子并将其与“F3′5′H”构建成能够在植物中进行道传转化的表达载体,为培育新型花色新品种奠定了基础。     

枸杞MYB转录因子LrAN2在番茄中的过量表达分析

为明确黑枸杞 LrAN2基因在花青素合成代谢中的调控机制,在与枸杞同属的番茄中做了进一步验证。黑枸杞 LrAN2基因参与调控黑色果实花青素生物合成代谢,同时诱导烟草产生紫色表型,受限于枸杞转基因组培技术,选择枸杞亲缘物种番茄进行 LrAN2转基因功能分析及其调控机制。基于前期分离的 LrAN2开放阅读框序列,通过表达载体构建,荧光定量分析,花青素含量的测定以及液相色谱分析方式对转基因番茄进行检测和分析。结果表明,在番茄材料Maker中过量表达 LrAN2基因,得到深绿色番茄植株。转基因番茄的各个组织部位均有不同程度的花青素积累,花、叶和根细胞中都存在颜色较深色素沉着,叶片中花青素含量和 LrAN2基因的表达量都是最高。 LrAN2的过表达上调DFR和 F3′5′H的表达水平,同时激活飞燕草色素和矢车菊色素的积累。说明 LrAN2基因能够调控花青素的合成。     

玉米大斑病菌黑色素合成还原酶基因酵母单杂交报告载体的构建

根据玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)黑色素合成还原酶基因St3HNR、St4HNR 5′端侧翼序列和酵母单杂交报告载体p HIS2.1多克隆位点,设计了带有限制性内切酶位点的特异性引物,并以玉米大斑病菌01-23菌株基因组DNA为模板,PCR扩增启动子区域长度约1 000 bp的片段,双酶切目的片段及载体p HIS2.1回收并连接,构建2个还原酶基因的酵母单杂交报告载体。结果表明,克隆到启动子区域长度为998 bp核酸片段,经PCR检测、测序、酶切鉴定,2个还原酶基因的酵母单杂交报告载体构建成功,为进一步研究还原酶与转录因子互作关系及明确黑素素合成调控机制奠定了基础。     

猪内源性反转录病毒5′非编码区启动子活性的分析

 【目的】构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒（PERV）5′非编码区（5′UTR）为启动子的萤光素酶表达载体，分析5′UTR的转录调控规律。【方法】将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上，转染瞬时表达细胞Cos-7，检测萤光素酶的表达。【结果】缺失R区的5′UTR显示出很强的启动子活性，U3重复区序列缺失的5′UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。【结论】在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降；U3重复区序列表现出增强子的活性。在5′UTR的下游序列中，包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强，同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5′UTR的转录活性。     

HbCoi1基因启动子酵母单杂pHIS载体的构建及互作蛋白筛选

茉莉酸是调节天然橡胶树产胶的主要激素,HbCoi1是茉莉酸信号的受体,研究HbCoi1基因的表达调控对了解橡胶树的产胶机理具有重要的意义。首先PCR扩增HbCoi1基因的启动子,然后将目标序列插入pHis2.1载体,构建酵母单杂诱饵载体。将该载体转入酵母Y187菌株感受态中,在缺失培养基上检测自转录激活,发现HbCoi1基因的启动子在3-AT浓度为10 mmol·L-1时自转录激活得到有效抑制。在此基础上,通过与橡胶cDNA文库进行酵母单杂筛选,得到了几个可能与Hbcoi1启动子发生互作的基因,其中包括DNA结合蛋白、核糖体蛋白和功能未知基因,旨在为深入研究Hbcoi1基因表达调控打下基础。     

F3′5′H基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化

类黄酮3′5′羟基化酶(Flavonoid-3’,5-’hydroxylase;F3′5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键性酶,能使花色素的合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素。从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到了约1.7kb的F3′5′H片段。F3′5′H的cDNA序列分析结果表明,克隆得到的序列与原序列同源性达到99.34%,开放读码框为1 521 bp,编码507个氨基酸。将推算的氨基酸序列与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,发现与文献报道的存在2个氨基酸差异,氨基酸同源率为99.6%。将此基因构建到含有35S启动子的植物表达载体PBI-F3′5′H上,并通过农杆菌介导法对粉红色矮牵牛进行了遗传转化,初步鉴定获得了转基因植株。     

酵母单杂交文库构建及巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子筛选

[目的]利用酵母单杂交文库筛选巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子,挖掘参与调控葡萄开花时间的因子,为揭示花期转变代谢通路和定向改良葡萄品种提供理论参考.[方法]利用PlantCARE分析预测VvFT基因启动子顺式作用元件,并以VvFT基因启动子为诱饵,利用酵母单杂交文库筛选技术,筛选作用在VvFT基因启动子上游的调控因子.[结果]葡萄VvFT基因启动子区域存在13种启动子顺式作用元件,包括A-box、CAAT-box和TATA-box组成型调控元件;光响应调控元件ATC-motif、Box 4、G-Box和GT1-motif;茉莉酸甲酯(MeJA)响应调控元件CGTCA-motif和TGACG-motif;干旱诱导的MYB结合位点元件MBS;玉米蛋白代谢必需的调控元件O2-site;参与生物钟控制的调控元件circadian;厌氧诱导必需调控元件ARE.以VvFT基因启动子为诱饵,筛选获得34条表达序列标签(EST),其中有21条为未知功能,有13条在植物生长、抗逆防御、信号转导、转录调控、蛋白酶等方面均有已知或预测的功能,包括转录抑制因子ft41、GRF1互作因子ft44、NAP1相关蛋白ft64及ft70分子伴侣DnaJ10.酵母单杂交点对点验证结果表明VvDnaJ10和VvFT基因启动子之间有相互作用.[结论]通过酵母单杂交文库筛选获取13条候选EST,虽然大部分EST功能预测分析结果与VvFT调控开花时间无明显的直接关系,但研究结果为进一步探索VvFT转录或表达水平控制葡萄开花时间的分子机制提供侯选基因.     

荷兰鸢尾‘玉妃’花色变异关键结构基因分析

【目的】花色变异对丰富观赏植物花色具有重要意义,但由于花色变异的不确定性,使其变异机理尚未弄清。荷兰鸢尾是重要球根观赏植物,通过探索荷兰鸢尾蓝紫色野生型‘展翅’及白色突变株‘玉妃’的显色分子机制及色素积累差异,为花色变异机理提供依据。【方法】本研究通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用（UHPLC-QTOF-MS）方法测定荷兰鸢尾2个品种花的花色素苷和黄酮醇的种类及含量。以荷兰鸢尾‘展翅’和‘玉妃’的旗瓣为材料,通过转录组测序,筛选花色素苷合成相关差异基因。以2个品种花发育不同时期为材料,对差异基因进行荧光定量PCR验证。【结果】代谢组分析结果表明,飞燕草素和矢车菊素及其衍生物在蓝紫色花中积累,在白色花中几乎没有积累,而黄酮醇类物质在白色‘玉妃’中含量上升。RNA-seq结果表明,共获得46 485个unigenes,其中27 073个unigenes被公共数据库功能注释,占全部unigenes的58.24%。获得701个差异表达基因,其中485个基因在‘玉妃’中上调表达,216个基因在‘玉妃’中下调表达。花色素苷途径中,2个二氢黄酮醇-4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）基因和1个黄酮醇合成酶（flavonol synthase,FLS）基因有差异表达,分别命名为IhDFR1、IhDFR2和IhFLS1。白色‘玉妃’中,IhDFR1和IhDFR2下调表达,IhFLS1上调表达,导致花色素苷含量显著降低和黄酮醇积累,使代谢流由花色素苷转向黄酮醇。3个基因的qRT-PCR结果显示,IhDFR1和 IhDFR2在蓝紫色花中随着花的发育表达量升高,在白色花中均低表达,IhFLS1在白色花中随着花的发育表达量升高,在蓝紫色花中均低表达,与RNA-seq结果保持一致。【结论】白色‘玉妃’中,IhDFR1和IhDFR2的低表达,及IhFLS1的高表达,使花色素苷积累受阻,部分代谢流由花色素苷转向黄酮醇,导致花色由蓝紫变为白色。     

越橘VcNAC072克隆及其促进花青素积累的功能分析

目的 分离越橘VcNAC072（NAM,ATAF1/2,CUC2）转录因子,分析其表达模式并探讨其在调控花青素合成过程中的功能,为进一步研究越橘花青素积累的调控机理提供理论基础。方法 以‘公爵’越橘（Vaccinium corymbosum ‘Duke’）为试材,克隆VcNAC072。通过农杆菌介导法获得转基因拟南芥,比较转基因和野生型拟南芥花青素积累的差异。利用酵母单杂交和瞬时表达试验,分析VcNAC072对MYB转录因子AtPAP1的转录调控。结果 克隆获得越橘VcNAC072,该基因CDS为1 032 bp,编码含有343个氨基酸的蛋白质,含有1个保守的NAC结构域。表达分析显示,该基因在不同发育阶段的果实中均可表达,但表达差异明显,在粉色和蓝色果实中表达量较高,在绿色果实中表达量最低。随着VcNAC072表达的升高,果实中花青素含量呈递增的趋势。分析AtPAP1启动子序列,发现其序列中包含NAC转录因子的结合位点。酵母单杂交和烟草瞬时表达试验结果表明,VcNAC072可与AtPAP1的启动子相互作用,并激活其表达。在野生型拟南芥中异位表达VcNAC072,其种子中花青素积累量显著高于野生型。结论 推测VcNAC072在越橘果实中正向调节花青素的积累。     

桃MYB转录因子调控花青素合成的研究进展

花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性色素,种类繁多,是形成植物各器官颜色的主要色素之一。桃树作为重要的经济果树和观赏植物,其花青素的种类和含量都会对品种性状、果实品质和观赏特性等方面有着重要的影响。MYB转录因子是目前植物中发现的最大的转录因子家族之一,具有调控植物花青素生物合成过程的作用。本文旨在对桃花青素合成调控关键转录因子家族MYB进行综述,以期为今后的植物花青素生物合成以及育种等方面研究提供理论基础。     

光对园艺植物花青素生物合成的调控作用

花青素是植物中一类重要的类黄酮化合物,在植物花朵、果实等器官色泽形成和抗氧化过程中起着重要作用。植物组织中花青素的形成依赖于光信号,但是光信号对花青素生物合成的调控机制及信号网络很大程度上还不清晰。本文简述了花青素生物合成及运转过程的研究进展,简要归纳了MYB、bHLH、WDR三类主要因子对花青素合成的转录调控作用,重点阐释光信号（光强、光质、光照时长）对植物花青素合成的调控作用。研究表明,光环境（光强、光质、光照时长）主要通过不同的光受体（UVR8、CRYs、PHOTs、PHYs）影响光信号通路重要因子COP1的泛素化能力和HY5的稳定性,以及其他光信号转录因子如光敏色素互作因子PIFs的稳定性,进而调控花青素的生物合成过程。这些光信号因子一方面直接结合到调控花青素合成的MYB、bHLH、WDR三大类转录因子上,转录激活或抑制它们的表达进而调控花青素的合成;另一方面,这些光信号因子通过与MYB、bHLH、WDR三大类转录因子蛋白互作,影响它们形成的MBW复合体稳定性,进而调控花青素的合成。此外,这些光信号因子还可以通过不依赖于MBW复合体的通路调控花青素的合成,如HY5通过调控miR858影响花青素的生物合成;另外,一些未知的光响应因子可能以不依赖MBW通路的方式直接或间接地调控花青素合成基因和液泡膜上的运转蛋白,改变液泡酸化,调节花青素的合成。同时,光信号会影响光合电子传递,光合电子传递链中的一些因子也会通过依赖和不依赖MBW的途径影响植物花青素的合成。这些途径如何协调以及哪些信号因子优先受光环境（光强、光质、光照时间）调控?本文为深入研究光信号对花青素生物合成的调控机理提供参考,以探索光调控花青素积累的有效途径及靶标分子,为利用基因工程、代谢工程和光环境调控手段改良园艺植物花青素积累提供理论基础。     

‘凤丹’牡丹花色变化过程中花瓣色素及相关基因表达

针对‘凤丹’牡丹在开放过程中花色由紫红色变白的现象,以‘凤丹’5个不同开放时期的花瓣为试验材料,分别运用色差仪、高效液相色谱仪和荧光定量PCR测定花色表型、花色素成分及质量分数和花青苷合成途径中相关基因的表达,进而分析花瓣色素与花青苷合成相关基因表达之间的关系。结果表明:随着花的开放,红色大幅减退,明度变大,彩度降低;‘凤丹’花中检测出2种花青苷(芍药花素-3,5-二葡糖苷和矢车菊素-3,5-二葡糖苷)和8种单体酚。花开放过程中,总花青苷和总黄酮质量分数逐渐减少,总花青苷质量分数降低幅度更大。花青苷合成相关结构基因PAL、DFR、ANS和转录因子MYB22、bHLH1的表达模式与总花青苷质量分数的变化趋势一致,而且这些基因的表达量与总花青苷质量分数均具有极显著正相关性。研究发现,‘凤丹’花色变化的主要原因是总花青苷质量分数大量减少。PAL、DFR、ANS是参与‘凤丹’花青苷合成的关键结构基因,转录因子MYB22及bHLH1可能对结构基因DFR和ANS的表达起着重要的调控作用。     

映山红亚属内品种间杂交F1代花色苷种类及定量分析

  目的  花色是植物的重要观赏性状,花色苷在花色呈现中起着决定性作用。对花色苷种类及其含量进行分析,可以为解析花瓣呈色的机理奠定基础。  方法  本研究以映山红亚属3个杂交组合的双亲及其子代共36份样品为对象,利用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱仪定性定量检测花瓣中花色苷的组分,并分析花色苷在亲子代中的分离变化规律。  结果  本研究中共检测到17种化合物,其中芍药色素3-O-半乳糖苷、飞燕草素3-半乳糖苷、锦葵素3-O-半乳糖苷和矮牵牛素3-半乳糖苷首次在映山红亚属植物中检测到。映山红亚属植物中的花青素以矢车菊素和芍药色素为主,且主要以阿拉伯糖苷的形式存在。其中矢车菊素3-阿拉伯糖苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷和芍药色素与映山红亚属花瓣的红色着色相关。飞燕草素3-阿拉伯糖苷、飞燕草素3-O-葡萄糖苷、锦葵素3-阿拉伯糖苷和锦葵素3-O-葡萄糖苷与映山红亚属花瓣的紫色着色相关,矮牵牛素3-O-阿拉伯糖苷与花瓣紫红色着色相关。花色苷的分离分析结果表明,矢车菊素类和芍药色素类糖苷表现出超亲遗传的特性,锦葵素3-阿拉伯糖苷、锦葵素3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素3-O-阿拉伯糖苷表现出偏向父本遗传的特性。  结论  本研究从花色苷种类和含量角度解析了映山红亚属花色呈色机制,同时也为花色育种的亲本选择提供了参考资料。      

西伯利亚白刺 NsMYB5调控果实花青素生物合成

基于西伯利亚白刺红果、黑果果皮转录组数据,本研究筛选并克隆获得一个与西伯利亚白刺果实花青素和原花青素合成代谢相关的R2R3-MYB转录因子,命名为 NsMYB5。该基因ORF为840 bp,编码279个氨基酸, NsMYB5具有完整的SANT、MYB domain及HLH-MYB domain结构域,属于R2R3-MYB转录因子,与调控花青素和原花青素合成相关的香雪兰 FhMYB5同源性较高。过表达 NsMYB5烟草花瓣和雄蕊积累大量花青素,呈现深紫色,而叶片和茎仅有少量花青素积累,局部呈现淡紫色。转基因株系中花的花青素和原花青素含量均显著高于野生型（P<0.05）。结果表明, NsMYB5可以正向调控花青素和原花青素的合成,这为西伯利亚白刺果实果皮呈色的分子遗传机理提供了理论依据。     

玉米ZmNLP5与ZmSTP1、ZmAAP2基因启动子区域相互作用的鉴定

氮(N)是控制玉米产量的主要限制性因素,玉米对氮素的利用效率可以通过增加碳(C)的有效性得以改善。玉米转运蛋白ZmSTP1和ZmAAP2在植物C/N产物的运输和卸载过程中起着重要作用,且两个基因的启动子区域均含有一个硝酸盐响应顺式元件(nitrate responsive cis element, NRE)。NIN-like protein(NLP)是一类保守的植物特异性转录因子,已在多种植物被证实在调控N响应中发挥关键作用,其中玉米ZmNLP5是介导氮信号转导和代谢分子网络的中枢基因之一。为了明确ZmNLP5是否能与ZmSTP1和ZmAAP2基因启动子区域的NRE结合,以玉米B73为实验材料,首次利用酵母单杂交技术检测ZmNLP5与ZmSTP1、ZmAAP2基因启动子区域的相互作用。结果表明,将pGADT7-ZmNLP5-1/2分别转化Y1H (pAbAi-ZmSTP1)和Y1H(pAbAi-ZmAAP2)菌株后,在SD/-Leu培养基上均有菌落生长,在含AbA抗生素浓度为200 ng·mL^-1的SD/-Leu培养基中只有Y1H(pAbAi-ZmAAP2/pGA...     

转录组及代谢组联合解析茄子果色上位遗传效应

【目的】茄子果色与商品果外观品质和价值密切相关,花青素是决定茄子果色的重要天然色素之一。通过基因表达和代谢物差异比较,解析上位基因互作调控茄子果皮花青素合成的作用机制,为不同果色茄子选育提供理论基础。【方法】以花青素合成结构基因ANS突变的白果色母本19141、花青素合成关键调控基因MYB1突变的白果色父本19147及其紫红果色F1代E3316茄子为试验材料,对商品果期果皮进行转录组测序和广靶代谢组分析。【结果】转录组测序分析表明,19141＿vs＿19147的差异表达基因（DEGs）最多,其次是E3316＿vs＿19141,两个比较组DEGs均在类黄酮途径富集程度最高;E3316＿vs＿19147筛选到的DEGs最少,未在类黄酮途径富集。广靶代谢组共检测分析到218个代谢物。E3316＿vs＿19141共检测到差异代谢物（DAMs）113个,E3316＿vs＿19147共检测到差异代谢物98个。转录组和代谢组联合分析发现花青素生物合成关键结构基因CHS、CHI、F3H、DFR和ANS,关键调节基因MYB1、AN1和AN11,修饰基因3GT、5GT、AT和OMT,还有转运基因AN9(G...