永生化绵羊附睾上皮细胞系的建立及其生物学特性分析

旨在建立绵羊附睾上皮永生化细胞系,为进一步研究绵羊附睾功能调节机制提供基础。本研究采用酶消化法分离培养原代绵羊附睾上皮细胞,利用脂质体将pCI-neo-hTERT质粒转入绵羊附睾上皮细胞(SEECs),经G418筛选得到了细胞系hTERT-SEECs,免疫荧光法鉴定其角蛋白18(CK18)和人端粒酶逆转录亚基(hTERT)表达情况;RT-PCR检测其hTERT mRNA的表达;采用CCK-8法绘制细胞生长曲线检测其增殖能力;利用流式细胞仪检测其周期和细胞凋亡情况;核型分析检测其倍体情况;从mRNA和蛋白水平检测其谷胱甘肽过氧化物酶5(GPX5)和雄激素受体(AR)的表达情况。结果显示,原代绵羊附睾上皮细胞呈典型的铺路石状形态。hTERT成功转入绵羊附睾上皮细胞,传45代后,hTERT-SEECs仍呈铺路石状;hTERT-SEECs仍可稳定表达CK18和hTERT,并且拥有正常的二倍体核型;hTERT-SEECs增殖能力高于原代细胞,hTERT-SEECs处于G1期的细胞比例显著低于SEECs(P0.05),处于S期细胞比例显著高于SEECs(P0.05),且其活细胞率显著高于SEECs(P0.05),凋亡率显著低于SEECs(P0.05); hTERT-SEECs和SEECs的GPX5和AR蛋白表达量差异不显著(P0.05)。本研究所建立的hTERT-SEECs经长期培养后仍具有正常的附睾上皮细胞形态,增殖能力强并保留了附睾上皮细胞的生物学特性。     

添加罗格列酮对小鼠卵母细胞氧化还原稳态的影响

【目的】探究在体外成熟培养基中添加罗格列酮(rosiglitazone, RSG)对小鼠卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响,为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】通过在体外成熟培养基中添加0、10、20、50、100μmol/L RSG,统计第一极体(PBⅠ)排出率,确定RSG最适浓度。根据RSG最适浓度筛选结果分为对照组和罗格列酮组,通过免疫荧光染色法检测卵母细胞内活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、组织蛋白酶B(CB)、线粒体膜电位水平(MMP)及囊胚内总细胞数(Hoechst 33342)和细胞凋亡比率(TUNNEL);使用实时荧光定量PCR检测囊胚内抗氧化相关基因(Sod-2、Gpx-3和Cat)和凋亡相关基因(Caspase-3、Bcl-2和Bcl-xl)转录水平。【结果】与对照组相比,添加20μmol/L RSG可显著提高小鼠卵母细胞第一极体排出率、卵裂率及囊胚率(P<0.05);卵母细胞内ROS和CB水平均显著降低,GSH和线粒体膜电位水平均显著提高(P<0.05);囊胚内总细胞数显著提高,细胞凋亡比率显著降低(P<0.05);抗氧化相关基因(Sod...     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响

利用包含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达载体pCI-neo-hTERT转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选阳性克隆扩大培养,并对转染阳性细胞分别进行RT-PCR检测,倍性分析,细胞周期检测和细胞凋亡检测,以观察该基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响.试验结果表明,筛选出的阳性细胞现已传至第50代;RT-PCR检测,端粒酶基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞并持续表达;倍性分析结果显示,转基因第50代细胞呈正常二倍体;对细胞周期进行分析,结果显示转基因第50代细胞较未转染第30代细胞有较高的S期,说明该细胞DNA合成旺盛,具有很强的增殖能力;细胞凋亡检测结果发现,转基因第50代细胞中凋亡细胞的比例明显少于转染第30代山羊胎儿成纤维细胞.这些试验结果均表明,hTERT能增加山羊胎儿成纤维细胞体外培养的代数,并保持细胞良好的形态及较强的增殖能力.     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响

利用包含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达载体pCI-neo-hTERT转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选阳性克隆扩大培养,并对转染阳性细胞分别进行RT-PCR检测,倍性分析,细胞周期检测和细胞凋亡检测,以观察该基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响。试验结果表明,筛选出的阳性细胞现已传至第50代;RT-PCR检测,端粒酶基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞并持续表达;倍性分析结果显示,转基因第50代细胞呈正常二倍体;对细胞周期进行分析,结果显示转基因第50代细胞较未转染第30代细胞有较高的S期,说明该细胞DNA合成旺盛,具有很强的增殖能力;细胞凋亡检测结果发现,转基因第50代细胞中凋亡细胞的比例明显少于转染第30代山羊胎儿成纤维细胞。这些试验结果均表明,hTERT能增加山羊胎儿成纤维细胞体外培养的代数,并保持细胞良好的形态及较强的增殖能力。     

线粒体凋亡途径在玉米赤霉烯酮致大鼠睾丸支持细胞凋亡中的作用

为探讨玉米赤霉烯酮(zearalenon,ZEA)雄性生殖毒性作用机理,研究ZEA诱导大鼠睾丸支持细胞(sertoli cell,SC)的凋亡途径,试验选取大鼠原代SC为研究材料,用不同浓度ZEA(0、5、10、20μmol/L)处理SC 24 h后,采用实时荧光定量PCR法检测Bax和Bcl-2 mRNA表达水平;用Western blotting法检测Bax、Bcl-2等线粒体凋亡途径相关蛋白表达;同时检测了20μmol/L ZEA联合Caspase-8抑制剂(Z-IETD-FMK)处理对SC凋亡率和线粒体凋亡相关蛋白的影响。结果显示,与对照组相比,20μmol/L ZEA组细胞Bcl-2转录水平显著下降(P<0.05),Bax转录水平显著上升(P<0.05);10、20μmol/L ZEA组Bax/Bcl-2比值及Cyto-CytC、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3表达量极显著上升(P<0.01),而Mito-CytC表达量极显著下降(P<0.01);与ZEA组相比,ZEA与Z-IETD-FMK联合处理可使ZEA诱导的SC凋亡率极显著下降(P<0.01),tBid/Bid、Bax/Bcl-2、Cyto-CytC、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9蛋白表达显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01),而Mito-CytC表达量极显著上升(P<0.01)。综合试验结果,ZEA能够通过线粒体途径诱导大鼠SC发生凋亡。     

胎牛血清在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用研究

【目的】研究胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用。【方法】本试验以体外培养第5天的猪孤雌激活囊胚为材料,将新鲜和冷冻囊胚分别在含10%FBS(V/V)的胚胎培养液中继续培养48 h,即分为新鲜组(Fresh)、新鲜+FBS组(Fresh+FBS)、冷冻组(Vitrified)、冷冻+FBS组(Vitrified+FBS)。观察各组囊胚的扩张和孵化能力,检测胚胎的细胞膜损伤、凋亡细胞数目、总细胞数目、胞内活性氧(ROS)水平、线粒体活性以及发育相关基因的表达水平。【结果】与Fresh和Vitrified组相比,Fresh+FBS和Vitrified+FBS组的完全扩张率、孵化率和囊胚细胞总数均显著提高(P<0.05),细胞膜损伤率和细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。与Fresh组相比,Vitrified组ROS水平显著升高(P<0.05),Fresh+FBS和Vitrified+FBS组ROS水平均显著降低(P<0.05)。Vitrified+FBS组的线粒体活性显著高于Vitrified组(P&l...     

猪RPL36A基因对PK15细胞增殖过程的影响

【目的】探究核糖体蛋白L36A(ribosomal protein L36A,RPL36A)基因对PK15细胞增殖过程的影响,为解析马身猪和大白猪生长速度差异的生理机制奠定基础。【方法】采用脂质体法将RPL36A基因干扰和过表达载体转染至PK15细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测RPL36A基因表达效率及细胞增殖标志基因(PCNA、Ki67、Cyclin B、CDK4)的表达变化,并通过划痕试验、CCK-8和EdU法检测细胞增殖情况。【结果】过表达RPL36A基因后,PK15细胞中PCNA、Ki67、CDK4基因mRNA表达量均极显著升高(P<0.01),Cyclin B基因mRNA表达量显著升高(P<0.05);PCNA蛋白表达量显著升高(P<0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量极显著高于空载组(P<0.01),细胞增殖速度升高;阳性细胞数极显著升高(P<0.01)。干扰RPL36A基因后,PK15细胞中PCNA、Cyclin B基因mRNA表达量均极显著降低(P<0.01),Ki67、CDK4基因mR...     

hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景

人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)诱导的永生化细胞兼具原代细胞的生物学特性和传代细胞系连续传代的能力,是一种理想的细胞来源,在基础研究、临床应用和生物工程领域具有无可比拟的优势。本文主要就hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景作一综述。     

肿瘤坏死因子-α对小鼠小肠类器官生长、屏障功能和肠道功能细胞的影响

【目的】研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对小肠类器官生长、紧密连接蛋白及各种功能细胞标记基因的影响,以建立小肠类器官的疾病损伤模型。【方法】取小鼠小肠,用温和细胞解离试剂(GCDR)消化液分离小鼠隐窝细胞并用肠道类器官培养基培养。选取0(对照组)、50、250、500 ng/mL TNF-α刺激小肠类器官48 h,光学显微镜下观察类器官生长情况,Edu染色示踪细胞增殖的情况,利用实时荧光定量PCR检测细胞增殖、屏障功能和肠道功能细胞标记基因mRNA表达水平。【结果】(1)与对照组相比,50和250 ng/mL TNF-α显著降低小肠类器官的出芽率(P<0.05),而对类器官形成率无影响(P>0.05);250和500 ng/mL TNF-α导致小肠类器官坏死率显著升高(P<0.05)。(2)与对照组相比,250 ng/mL TNF-α显著降低小肠类器官紧密连接蛋白Occludin mRNA表达量(P<0.05);500 ng/mL TNF-α显著提高小肠类器官紧密连接蛋白Claudin-1 mRNA表达量(P<0.05)。(3)与对照组相比,50、250...     

犬脂肪来源间充质干细胞对重症急性胰腺炎体外内质网应激模型的抗凋亡作用

【目的】 探究犬脂肪组织来源的间充质干细胞(cAd-MSCs)对重症急性胰腺炎(SAP)体外模型的抗凋亡作用,以期为利用干细胞治疗胰腺炎提供理论指导。【方法】 ①用Ⅰ型胶原酶消化分离cAd-MSCs,用流式细胞术鉴定其干细胞标志物CD29、CD34、CD44、CD45、CD73和CD90的表达,用成脂、成骨和成软骨分化来鉴定其多向分化潜能;②用Ⅰ型胶原酶从小鼠胰腺组织中分离胰腺腺泡细胞(PACs),用实时荧光定量PCR检测PACs及胰腺组织中胰腺导管特异性基因CK19、β-胰岛细胞特异性细胞基因Insulin-1、α-胰岛细胞特异性基因Glucagon及PAC特异性基因PTF-1α、CPA-1、AMY2B的表达;③以10、20 μg/mL脂多糖(LPS),10、100 mmol/L雨蛙肽(Caerulein)以及10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein处理PACs,不添加药物培养的细胞为对照组,培养24 h后使用CCK-8检测PACs存活率,筛选体外构建内质网应激模型的最佳处理组(即模型组,P);用CCK-8检测对照组(Naive)及模型组(P)细胞0、2、4、8、12和24 h的存活率,Western blotting检测P组细胞内质网应激相关蛋白的相对表达量;④为确定cAd-MSCs对PACs的作用方式,试验分为PAC组(仅PACs,Naive)、P组、间接共培养组(IC)、直接共培养组(构建PAC模型时与cAd-MSCs直接共培养,DC),用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF-α)基因在PACs中的表达水平;⑤在间接共培养系统中,将细胞分为空白对照组(仅PACs,Naive)、对照组(PACs与cAd-MSCs共培养,C)、P组及试验组(药物处理的PACs与cAd-MSCs细胞共培养,T),细胞培养12 h后,通过实时荧光定量PCR、Western blotting检测各组细胞内质网应激相关基因及蛋白表达水平的变化,并用TUNEL法检测各组细胞的凋亡情况。【结果】 ①分离培养的cAd-MSCs呈现成纤维样细胞形态,高表达干细胞标志物CD29、CD44、CD73及CD90,不表达CD34和CD45,且具备成脂、成骨、成软骨分化能力;②分离的原代PACs呈鹅卵石样,与胰腺组织相比较,AMY2B、CPA1、PTF1α基因的相对表达量均显著增加(P<0.05),CK19、Glucagon、Insulin-1基因的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。③与对照组相比,10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein组细胞存活率极显著降低(P<0.01),因此选为构建内质网应激模型的最佳处理组。与对照组相比,4 h时P组PACs的细胞存活率显著降低(P<0.05),8、12、24 h均极显著降低(P<0.01);Western blotting检测结果显示,Grp78、CHOP、Caspase-12蛋白的表达水平自4 h开始均极显著增加(P<0.01)。④与Naive组相比,P组TNF-α基因的表达水平极显著增加(P<0.01);与P组相比,IC和DC组TNF-α基因表达水平均极显著降低(P<0.01),后续用间接共培养系统进行试验。⑤在间接共培养系统中,与P组相比,T组Grp78、Caspase-12和CHOP mRNA及蛋白的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。TUNEL检测结果显示,T组阳性细胞数明显减少。【结论】 本试验成功构建SAP体外内质网应激模型,且证明cAd-MSCs对PACs内质网应激具有调控及保护作用。     

他莫昔芬对猪伪狂犬病病毒体外增殖的影响

【目的】 研究他莫昔芬（Tamoxifen）在PK15细胞模型上对猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染的抗病毒作用。【方法】 以PK15细胞为模型,采用CCK-8细胞计数法检测他莫昔芬对细胞活力的影响;利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒检测他莫昔芬对细胞周期和凋亡的影响;利用CytoFLEX流式细胞仪和荧光显微镜检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-GFP后病毒增殖的差异;利用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后PRV gB基因mRNA和蛋白表达水平的变化;利用病毒滴度测定法检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后对病毒的抑制情况。【结果】 他莫昔芬用药浓度在6 μmol/L时对细胞活力无影响;在6 μmol/L以下时,与空白组相比,他莫昔芬处理组对细胞周期与凋亡没有显著影响（P>0.05）。在同一时间点,他莫昔芬处理组PRV-GFP在PK15细胞中的增殖速度极显著低于对照组（P<0.01）;实时荧光定量PCR结果表明,他莫昔芬处理后极显著抑制了PRV gB基因mRNA在PK15细胞中的表达（P<0.01）;Western blotting结果显示,不同给药浓度同一时间点,他莫昔芬都显著或极显著抑制了PRV gB蛋白的表达（P<0.05;P<0.01）;病毒滴度测定结果表明,在PK15细胞中,同一时间点他莫昔芬处理组的PRV-QXX子代病毒的复制速度显著或极显著低于对照组（P<0.05;P<0.01）。【结论】 他莫昔芬能显著抑制PRV在PK15细胞中的增殖。     

双氢睾酮对小鼠卵泡颗粒细胞增殖与抗苗勒管激素表达的影响

【目的】探讨双氢睾酮(DHT)对小鼠颗粒细胞增殖与抗苗勒管激素(AMH)表达的影响。【方法】给3周龄的昆明小鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG,10 IU/只)以获取颗粒细胞,颗粒细胞传代后48 h HE染色鉴定形态,绘制颗粒细胞的生长曲线,免疫荧光法鉴定促卵泡素受体(FSHR)的表达。当第2代颗粒细胞汇合度达到50%时,先用无血清的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h,然后在培养基中添加不同浓度的DHT (0、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol/L),培养48 h后检测颗粒细胞增殖情况,实时荧光定量PCR法及ELISA法分别测定AMH基因及蛋白的表达。在颗粒细胞培养液中分别添加10^-6 mol/L Flutamide (雄激素受体(AR)特异性抑制剂)、10^-7 mol/L DHT、10^-7 mol/L DHT+10^-6 mol/L Flutamide、10^-5 mol/L DHT、10^-5mol/L DHT+10^-8 mol/L 11-ketodihydrotestosterone (AR特异性激动剂),分别记为F、D7、DF、D5、DK组,以不添加药物为对照组。培养48 h后,检测各组颗粒细胞增殖及AMH蛋白含量。【结果】体外培养的小鼠颗粒细胞呈梭形或铺路石状,生长曲线呈S形,细胞普遍表达FSHR;与0 mol/L DHT组相比,10^-8、10^-7 mol/L DHT组细胞增殖分别显著和极显著增加(P＜0.05;P＜0.01),10^-5 mol/L DHT组细胞增殖显著降低(P＜0.05);10^-7 mol/L DHT组AMH基因的相对表达量和AMH蛋白含量均极显著增加(P＜0.01)。与D7组相比,DF组颗粒细胞增殖和AMH蛋白含量均极显著降低(P＜0.01);与D5组相比,DK组颗粒细胞增殖和AMH蛋白含量均极显著升高(P＜0.01)。【结论】10^-7 mol/L DHT能够显著促进颗粒细胞增殖和AMH表达,而10^-5 mol/L显著降低了颗粒细胞增殖以及AMH表达,且AR介导了DHT调控颗粒细胞增殖和AMH表达。     

MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

【目的】 构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO)，研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)复制的影响。【方法】 根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】 试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】 本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。     

内蒙古绒山羊KAP9.2基因遗传多态性及其与生长性状的关联分析

【目的】 探究内蒙古绒山羊KAP基因家族角蛋白相关蛋白9.2（KAP9.2）基因插入/缺失（insertion/deletion,InDel）突变及其与生长性状的关系,以期为内蒙古绒山羊分子育种提供理论基础。【方法】 选取606只雌性阿拉善型内蒙古绒山羊为研究对象,采集耳组织提取DNA并测定其体重及体高、体长和胸围等体尺数据,利用琼脂糖凝胶电泳方法与直接测序技术检测KAP9.2基因的InDel突变,检测遗传多样性指标,利用SPSS 23.0软件分析突变位点与生长性状的关联性。【结果】 在内蒙古绒山羊KAP9.2基因外显子区存在30 bp的InDel突变,产生II、ID和DD 3种基因型。多态信息含量（PIC）显示,该位点在育成羊群体中属于中度多态（0.25<PIC<0.50）,在成年羊群体中属于低度多态（PIC<0.25）,且均处于哈代-温伯格平衡状态（P>0.05）;在整个群体中,属于低度多态（PIC<0.25）,但偏离哈代-温伯格平衡状态（P<0.05）。关联分析结果表明,在育成羊群体中,此30 bp的InDel突变对体长和十字部高有显著影响（P<0.05）,对体高、胸深和胸宽有极显著影响（P<0.01）;在成年羊群体中,此突变对管围、胸深和胸宽有极显著影响（P<0.01）。进一步的分析发现,在育成羊和成年羊全部群体中,此突变对体长和十字部高有显著影响（P<0.05）,对体高、胸深和胸宽有极显著影响（P<0.01）。【结论】 KAP9.2基因InDel突变对阿拉善型内蒙古绒山羊多个生长性状有显著或极显著影响,可作为内蒙古绒山羊优良性状选育的分子标记。     

新型滴鼻灭活鹦鹉热衣原体疫苗的免疫效力评价

【目的】 探究由霍乱弧菌菌影(Vibrio cholerae ghosts,VCG)和纳米壳聚糖凝胶(Gel)组合制作的一种新型灭活衣原体疫苗复合佐剂是否可增强鹦鹉热衣原体原体(elementary body,EB)灭活抗原诱导动物机体产生的免疫应答。【方法】 将60只7日龄SPF鸡随机分为4个组,分别为:EB＋VCG＋Gel组、EB＋VCG 组、Gel组和EB组。通过滴鼻途径免疫鸡群,免疫2次,每次间隔14 d,免疫后检测鸡血清中IgG抗体水平、淋巴细胞增殖指数、CD4^＋/CD8^＋T 细胞比例、细胞因子(白介素-4(IL-4)、IL-10、IL-12和干扰素-γ(IFN-γ))含量及攻毒后鸡喉头排菌量和肺脏的病理损伤程度。【结果】 与Gel和EB组相比,EB＋VCG＋Gel和EB＋VCG组IgG 抗体水平、淋巴细胞增殖指数、IFN-γ含量和CD4^＋/CD8^＋T细胞比值显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01)。此外,与Gel和EB组相比,攻毒后第12天,EB＋VCG＋Gel组喉头排菌量极显著降低(P<0.01),攻毒后第7天,肺脏损伤评分极显著降低(P<0.01)。【结论】 壳聚糖凝胶、VCG、灭活衣原体 EB 组合构成的新型滴鼻衣原体疫苗经鼻腔接种动物后可刺激动物机体产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,阻断鹦鹉热衣原体经呼吸道途径传播,防止鹦鹉热衣原体从动物向人群传播。     

辣蓼黄酮正丁醇部位对PRV感染3D4/2细胞氧化应激相关因子水平的影响

【目的】探究辣蓼黄酮正丁醇部位(N-butanol fraction of Polygonum hydropiper flavonoids, FNB)对猪伪狂犬病毒(Pseudoabies virus, PRV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(3D4/2细胞)氧化应激相关因子的影响,旨在初步分析FNB的抗氧化效果。【方法】采用10^-1至10^-10浓度PRV体外感染猪肾细胞(PK15细胞),计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID₅₀);将3D4/2细胞分为BC组、DMSO组、PRV组、FNB 1、FNB2和FNB3组,BC组用DMEM培养液处理,其余各组用感染复数(multiplicity of infection, MOI)=0.1 RPV处理,孵育2 h后,PRV组添加DMEM培养液,DMSO组及FNB1、FNB2、FNB3组分别添加0.05%DMSO及12.5、25、50μg/mL FNB的DMEM培养液。培养4、8、12、24 h后,分别收取各组细胞培养液上清和细胞,通过试剂盒测定细胞培养液上清中一氧化氮(NO)的含量、细...     

禽网状内皮组织增生病病毒感染对SPF雏鸡法氏囊细胞Bcl-2和C-myc基因表达及凋亡的影响

【目的】 探究禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染禽类后导致免疫器官发生细胞凋亡的机理。【方法】 以1日龄SPF雏鸡为试验对象,将100只SPF雏鸡随机均分为REV感染组和未感染病毒的对照组,REV感染组雏鸡经腹腔感染500 μL REV稀释液,对照组雏鸡经相同途径注射等量灭菌生理盐水,于病毒感染后第1、7、14、21、28和42天,2组雏鸡随机各抽取5只,心脏采血处死雏鸡后快速摘取法氏囊。分别应用HE染色和病理切片成像系统测定分析法氏囊细胞核浆比,TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒测定凋亡细胞数,免疫组化法测定Bcl-2和C-myc阳性细胞数量,实时荧光定量PCR和ELISA法分别检测法氏囊Bcl-2和C-myc 基因mRNA表达和蛋白含量。【结果】 ①REV感染1日龄SPF雏鸡后21~42 d,其法氏囊淋巴细胞凋亡百分比显著或极显著高于对照组雏鸡(P<0.05;P<0.01);②SPF雏鸡感染REV后21和28 d,其法氏囊细胞核浆比显著低于对照组雏鸡(P<0.05);③REV感染SPF雏鸡法氏囊中Bcl-2和C-myc阳性细胞数在病毒感染后21和28 d显著高于对照组雏鸡(P<0.05);④REV感染SPF雏鸡后21 d,其法氏囊Bcl-2和C-myc 基因mRNA表达极显著高于对照组雏鸡(P<0.01)。⑤SPF雏鸡感染REV后,其法氏囊中Bcl-2蛋白含量较对照组雏鸡有不同程度的增加,其中21和28 d分别差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05),病毒感染组雏鸡的C-myc蛋白含量也始终高于对照组雏鸡,且21和28 d极显著增高(P<0.01)。【结论】 REV感染所致SPF雏鸡法氏囊细胞Bcl-2和C-myc的mRNA表达以及蛋白含量异常均与病毒感染导致的法氏囊细胞凋亡密切相关,而法氏囊细胞凋亡数量增加与REV感染引发的机体免疫机能抑制密切相关。     

槲皮素对PEDV感染幼龄仔猪的生长性能、血液生化指标和肠道吸收与屏障功能的影响

【目的】 试验旨在探讨槲皮素在防治仔猪感染猪流行性腹泻病毒（PEDV）中的作用。【方法】 选取18头体重相近、健康的7日龄仔猪（杜×长×大）,随机分为3组（对照组、PEDV组和PEDV+槲皮素组）,每组6个重复,每个重复1头猪,试验期共11 d。经过3 d适应期后,于试验第4~10天给PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服10 mg/kg BW的槲皮素,其他组仔猪口腔灌服等体积的人工乳,于试验第8天给PEDV组与PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服1×10^4.5TCID₅₀的PEDV,对照组灌服等体积的PBS溶液。试验第11天早上空腹称重,全部仔猪灌服D-木糖（0.1 g/kg BW）,1 h后经前腔静脉采血,检测血液生化指标、血浆二胺氧化酶（DAO）活性和D-木糖含量;将所有仔猪屠宰取空肠黏膜,检测肠道屏障相关基因,包括肠绒毛蛋白（villin）,紧密连接蛋白-1（claudin-1）,闭合蛋白（occludin）和肠型脂肪酸结合蛋白（iFABP）的相对表达量。【结果】 与对照组相比,PEDV组仔猪平均日增重显著下降（P<0.05）,粪便评分显著升高（P<0.05）;血液中高密度脂蛋白含量显著降低（P<0.05）,肌酐和尿素氮的含量显著提高（P<0.05）;血浆中D-木糖含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、iFABP基因的相对表达量显著下调（P<0.05）。与PEDV组相比,PEDV+槲皮素组仔猪平均日增重和血浆D-木糖含量显著升高（P<0.05）;血液中肌酐和尿素氮的含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、villin和iFABP基因的相对表达量显著上调（P<0.05）。【结论】 10 mg/kg BW槲皮素可在一定程度上缓解PEDV感染导致的仔猪生长抑制和肾功能损伤,增强肠道吸收与屏障功能。     

藏绵羊KLF7基因表达特征分析及其过表达对前脂肪细胞增殖分化的影响

【目的】分析藏绵羊Krüppel样因子7(Krüppel-like factor 7,KLF7)基因表达特征,研究过表达该基因对前脂肪细胞增殖及分化的影响。【方法】从藏绵羊脂肪组织中分离前脂肪细胞进行培养及成脂诱导,应用实时荧光定量PCR技术检测KLF7基因在藏绵羊7个组织(大脑、皮下脂肪、肾脏、背最长肌、瘤胃、睾丸和回肠)和前脂肪细胞不同分化阶段(第0、2、4和8天)的mRNA相对表达水平;应用RT-PCR方法从藏绵羊脂肪组织中扩增KLF7基因CDS区序列,并将其连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体获得pcDNA3.1-KLF7过表达质粒,转染前脂肪细胞;应用实时荧光定量PCR方法检测脂肪细胞增殖及分化标志基因mRNA表达水平;采用EdU和CCK-8方法分别检测过表达KLF7基因对EdU阳性细胞数和细胞活力的影响;采用油红O染色检测过表达KLF7基因后脂肪细胞脂滴生成量。【结果】KLF7基因在藏绵羊7个组织中均有表达,其中在大脑中的表达量最高,其次为皮下脂肪和肾脏,均显著高于其他组织(P<0.05);诱导分化第2、4和8天脂肪细胞mRNA表达量均显著高于分化前(P＜0.05),且分化第2天表达量最高;pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞2 d后显著或极显著抑制增殖标志基因CDK4、CyclinB1和CyclinD1的表达水平(P＜0.05;P＜0.01),极显著降低细胞活力及EdU阳性细胞数量(P＜0.01);pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞,诱导分化8 d后,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、Glut4和ELOVL6的mRNA相对表达水平显著或极显著下调(P＜0.05;P＜0.01),且脂质沉积极显著减少(P＜0.01),表明过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞增殖及分化。【结论】KLF7基因在藏绵羊多个组织中广泛表达,且大脑、皮下脂肪、肾脏中表达量较高;诱导分化后脂肪细胞表达量显著高于分化前,且分化第2天表达量最高;过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞的增殖及分化。试验结果为阐明藏绵羊脂肪沉积的分子调控机制提供了基础数据。