犬弓首蛔虫性别相关基因Tc-vit、Tc-iom、Tc-tpk、Tc-stp在不同生殖器官中的差异表达分析

为对犬弓首蛔虫(T.canis)免疫抑制卵巢信息蛋白(Tc-iom)、卵黄原蛋白(Tc-vit)、酪氨酸蛋白激酶(Tctpk)和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(Tc-stp)四个性别相关基因进行差异表达分析。本研究采用SYBR Green I qRT-PCR方法检测Tc-vit、Tc-iom、Tc-tpk、Tc-stp在T.canis雌虫卵巢、输卵管、子宫和雄虫精巢、贮精囊、输精管的转录情况。结果显示,Tc-vit在雌虫卵巢、输卵管和子宫中均有转录,在雄虫精巢和贮精囊中也有转录,但在输精管中无转录;Tc-iom在雌虫卵巢、输卵管和子宫中高水平转录,在雄虫精巢和贮精囊中转录量较低,输精管中无转录;Tc-tpk在雄虫精巢和贮精囊中的转录明显高于其他生殖组织;Tc-stp在雄虫精巢和输精管中转录量较高,在雌虫卵巢、输卵管和子宫中转录量较低。本试验为T.canis性别相关基因的进一步研究奠定了基础。     

捻转血矛线虫ES24抗原基因的克隆与表达特性分析

根据捻转血矛线虫ES24抗原基因序列(U64793.1)设计1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出大小约为670 bp的DNA片段。将该DNA片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果发现该基因与GenBank中已知的捻转血矛线虫24 ku ES抗原基因的相似性达96%～98%。将该基因的开放阅读框插入pET28a(+)载体中,获得原核表达质粒pET28/ES24,并转化大肠杆菌BL21。重组细菌用IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,结果表明该基因获得了表达,重组蛋白分子量大小约为25 ku。用实时荧光定量PCR技术对该基因在捻转血矛线虫的虫卵、第3期幼虫、雌虫和雄虫等不同发育阶段、不同性别虫体内的表达情况进行了定量分析,结果显示ES24基因在雄性成虫中表达量最高,雌虫和虫卵其次,在第3期幼虫中表达最低。     

猪蛔虫微管蛋白α-链基因(13E09)在不同发育期的mRNA表达研究

猪蛔虫病严重危害我国养猪业的发展,通过研究在感染期的表达基因来研究其发育繁殖机制,以达到预防和控制该病的目的已成为猪蛔虫研究的发展趋势。本研究以β-actin为内参,采用半定量RT-PCR方法鉴定分析猪蛔虫微管蛋白α-链基因(13E09)丰度随不同阶段虫体在虫体不同发育阶段的mRNA表达水平的变化,结果显示,该在感染期幼虫呈高丰度表达外,肠四期即(L4)幼虫也有多量表达,在雄虫、虫卵期也有少量表达,但在雌虫和肺三期幼虫均未检测出该基因的表达,该基因是在感染期幼虫呈高丰度表达的基因,可能在感染宿主过程中起重要作用。这为进一步研究该基因的功能提供了科学依据。     

捻转血矛线虫半胱氨酸蛋白酶对山羊PBMCs免疫功能的影响

旨在探究捻转血矛线虫半胱氨酸蛋白酶(Hc58)对山羊外周血单个核细胞(PBMCs)免疫功能的影响。采集健康山羊血液,分离出PBMCs和单核细胞,分别以质量浓度为0、10、20、40μg·mL-1的重组蛋白Hc58与细胞体外共培养,采用硝酸还原酶法测定不同浓度Hc58对单核细胞分泌一氧化氮(NO)的影响;采用流式细胞术检测重组蛋白对单核细胞吞噬FITC-dextran能力的影响;采用荧光定量PCR检测PBMCs中IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β的mRNA转录情况;采用迁移小室研究重组蛋白对PBMCs迁移的影响;采用流式细胞术检测不同浓度Hc58对PBMCs凋亡的影响。研究表明重组蛋白Hc58显著促进山羊单核细胞分泌NO;并且增强了山羊单核细胞的吞噬能力;Hc58显著上调IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表达量;Hc58显著提高山羊PBMCs凋亡比例,也使PBMCs迁移率增加。捻转血矛线虫半胱氨酸蛋白酶能通过多种途径影响宿主PBMCs发挥免疫作用。     

日本血吸虫幼虫巨大致死基因片段的克隆、表达及免疫效果分析

为研究日本血吸虫(Schistosoma japonnicum)幼虫巨大致死基因(Lethal giant larvae)的生物学功能,本研究应用荧光定量RT-PCR分析SjLgL基因在S.japonnicum不同发育阶段的表达情况,构建重组表达质粒pET-SjLgL进行诱导表达,对重组蛋白进行western blot鉴定;重组蛋白刺激免疫动物进行免疫保护试验,检测IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的变化.结果表明,SjLgL基因在S.japonnicum不同发育时期均有表达,成虫期略高于童虫,雄虫高于雌虫.Western blot鉴定结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原性.免疫保护试验结果表明,免疫小鼠分别获得了22.34％的减虫率和55.49％的肝脏减卵率.血清学检测结果显示重组蛋白免疫小鼠后产生了特异性IgG抗体.细胞因子检测结果表明,重组蛋白刺激免疫动物主要诱发产生Th1型的免疫应答.本实验结果表明该重组蛋白在小鼠体内可诱导产生部分免疫保护效果.     

日本血吸虫Wnt受体蛋白SjFz5在不同发育阶段的组织定位及mRNA表达水平分析

为研究日本血吸虫(Sj)Wnt信号分子受体SjFz5(Frizzled5)在Sj生长发育中的作用,本实验对其在不同发育阶段的mRNA转录水平及组织分布进行了检测,并采用定量PCR方法比较SjFz5基因在Sj不同发育阶段间的mRNA水平差异。以7 d童虫cDNA为模板,扩增SjFz5基因编码胞外区CRD(Cystein rich domain)的基因片段,构建pET-SjFz5-CRD表达重组质粒进行原核表达。以纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并进行SjFz5蛋白的组织定位。结果显示:SjFz5基因mRNA在发育早期表达水平相对较高,其中7 d童虫中表达量最高,13 d和18 d童虫下调了约1/3。23 d及其后雌雄虫的表达水平继续下调,雄虫下调比雌虫略显缓慢。整个成虫阶段SjFz5 mRNA维持在一个相对较低的水平。免疫组化结果显示SjFz5蛋白在虫体组织中分布广泛,其中雌雄虫生殖器官组织中的分布最为明显。随着卵巢和睾丸的逐步发育,SjFz5蛋白的量也呈现增加的趋势。SjFz5 mRNA在7 d童虫内表达量最高,SjFz5蛋白在雌雄生殖器官组织中分布最为明显,提示其介导的Wnt信号通路可能参与调节童虫阶段的细胞增殖、器官分化,并可能调节两性生殖细胞的发育。     

Novel＿miR218对山羊外周血单核细胞中SLAM受体表达的影响

为研究山羊源novel_miR218对小反刍兽疫病毒(PPRV)在淋巴细胞的主要受体——淋巴细胞信号活化分子(SLAM)表达水平的调节作用,通过荧光定量PCR法和Western blot技术检测PPRV疫苗毒N75-1株接种山羊外周血单核细胞(PBMCs)中SLAM和novel_miR218表达变化以及病毒增殖水平,然后检测novel_miR218模拟物(novel_miR218mimic)和拮抗物(novel_miR218inhibitor)转染山羊PBMCs中SLAM表达水平变化及对PPRV增殖的影响。结果表明,山羊PBMC感染PPRV后24h(hpi)即可检测到细胞病变效应,特别在感染后48～72hpi尤为明显;与对照组相比,PPRV感染组中SLAM受体mRNA表达水平在24hpi极显著升高(P0.01),随后逐渐降低,而novel_miR218表达水平在24hpi极显著降低(P0.01),随后逐渐升高,对照组中novel_miR218和SLAM的mRNA表达水平在各检测时间点未发现显著变化;感染组中SLAM受体的蛋白表达规律与其mRNA表达相似,而PPRV-N蛋白的表达水平呈现不断增加的趋势;novel_miR218mimic转染组中SLAM和PPRV-N蛋白表达水平较对照组显著降低(P0.05或P0.01),且呈转染剂量依赖性,而novel_miR218inhibitor转染组中SLAM和PPRV-N蛋白表达水平较对照组显著升高(P0.05或P0.01),且呈转染剂量依赖性。结果表明,PPRV感染山羊PBMCs中novel_miR218和SLAM表达水平具有相关性,细胞转染检测结果提示novel_miR218对SLAM受体的表达水平具有负调控作用并影响PPRV在山羊PBMCs中的复制水平。     

捻转血矛线虫谷胱甘肽过氧化物酶体外对山羊外周血单核细胞功能的影响

本文探讨了捻转血矛线虫的谷胱甘肽过氧化物酶(HC29)体外对山羊外周血单核细胞(PBMCs)功能的影响。颈静脉采取无捻转血矛线虫感染的山羊血液,分离单核细胞后加入终浓度为5μg/mL的HC29重组蛋白进行体外培养,通过免疫荧光抗体技术观察重组蛋白与单核细胞的结合情况;HC29刺激山羊外周血单核细胞,用qPCR技术测定各试验组单核细胞中IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-βmRNA的转录水平;重组蛋白刺激单核细胞,采用CCK-8法测定细胞的增值情况;将重组蛋白与巨噬细胞共培养,测定巨噬细胞吞噬和分泌NO的情况。结果表明,重组HC29能够与外周血单核细胞结合并刺激细胞因子IL-10和IFN-γ的表达水平显著提高(P<0.01),能够引起单核细胞增值(P<0.01),巨噬细胞吞噬作用增强(P<0.01)和NO分泌增加(P<0.01)。结果表明HC29是捻转血矛线虫的一个重要抗原,主要诱导Th1类免疫反应。     

猪蛔虫感染相关基因28A02的表达谱及其全长cDNA的克隆和分析

为鉴定猪蛔虫与感染相关的差异表达基因,本实验由猪蛔虫感染期幼虫差异消减cDNA文库中挑选EST序列(28A02)为研究对象,首先,经半定量RT-PCR方法分析该基因在各期虫体的表达情况。结果显示:该基因在猪蛔虫感染期幼虫和肺三期幼虫中均有表达,并且在感染期幼虫表达丰度最高,在其它各期虫体包括雌虫、雄虫、虫卵和第四期幼虫均未检测出该基因的表达。其次,以已知的EST序列为模板,采用RACE技术获得了864 bp的全长cDNA序列,包含一个完整的长约450 bp的开发阅读框。另外,经生物信息学分析显示,该基因编码的氨基酸序列与众多物种的ATP合酶有43%～47%的相似性,推测该基因可能参与编码猪蛔虫的线粒体ATP合酶,这为进一步研究其功能奠定了基础。     

重组鸡GSTA3蛋白对福美双诱导胫骨软骨发育不良肉鸡红细胞免疫相关基因转录的影响

为研究胫骨软骨发育不良(TD)肉鸡红细胞免疫相关基因转录水平的变化及重组鸡谷胱甘肽S-转移酶A3(chGSTA3)蛋白对TD肉鸡红细胞免疫相关基因转录的影响,将120只肉雏鸡饲喂一周后,随机分为基础日粮组(A、B、C组)和福美双处理组(D、E、F组),对福美双处理组肉鸡通过饲料中添加100mg·kg~(-1)福美双诱发建立肉鸡TD模型,通过腿部肌肉注射法,对B组和E组肉雏鸡注射有活性的低剂量(20μg·kg~(-1))重组GSTA3蛋白,对C组和F组肉雏鸡注射高剂量(50μg·kg~(-1))重组GSTA3蛋白,对A和D组的肉雏鸡注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS);使用Real-time PCR对肉鸡红细胞中免疫基因的信使RNA(mRNA)转录水平进行检测。结果显示,Toll样受体(TLR)2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、髓样分化因子88(MyD88)、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ、核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族中的C5型受体(NLRC5)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白细胞介素-7(IL-7)基因可以在鸡红细胞转录;福美双处理组D与磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理组A相对比,TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MyD88、TRAF6、MHCⅡ和NLRC5在试验的第4天显著升高,IL-7显著降低(P0.05),在试验的第15天TD肉鸡红细胞中TLR2、TLR4、MyD88和NLRC5显著下调(P0.05),IL-7、TLR3、TLR5、TLR7、TLR15、MHCⅡ、TRAF6变化不明显(P0.05);E组和F组与D组相比,在试验第4天,除E组TLR4、TLR5和MyD88外,其余基因都有显著性变化(P0.05);在第15天,E组中TLR4、TLR5、MyD88和NLRC5,及F组中TLR3、TLR5、MyD88、TRAF6和IL-7变化不显著,其他基因都有显著性差异(P0.05)。鸡红细胞可能通过免疫相关基因TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、IL-7、MyD88、TRAF6、MHCⅡ和NLRC5转录水平的变化,在早期诱导TD发生,后期减轻肉鸡TD症状;GSTA3能够对福美双诱导肉鸡TD的作用产生影响。     

绵羊痒螨巨噬细胞迁移抑制因子重组蛋白对兔外周血单个核细胞Th1/Th2型和Th17/Treg型特征因子表达的影响

为了初步探讨绵羊痒螨巨噬细胞迁移抑制因子（PoMIF）对健康新西兰兔外周血单个核细胞（PBMC）中Th1/Th2和Th17/Treg细胞平衡的变化。采用RT-PCR从绵羊痒螨总RNA中扩增得到MIF全长基因，经原核表达、纯化重组PoMIF（rPoMIF）蛋白，并分析其氧化还原酶和互变异构酶活性。筛选与健康新西兰兔PBMC孵育的最佳rPoMIF浓度，且用最佳浓度rPoMIF（0.2 μg·mL^-1）与PBMC共同孵育0、1、6、12、24、36 h后收集细胞，用荧光定量PCR检测其Th1/Th2/Th17/Treg细胞相对应的特征性转录因子T-bet/GATA-3/RORc/Foxp3和特征性细胞因子IFN-γ/IL-4/IL-17A/IL-10 mRNA表达变化。结果表明：PoMIF全长363 bp，rPoMIF大小为32 ku（含pET32a标签蛋白19 ku），且具有互变异构酶活性；rPoMIF刺激后PBMC中Th1细胞的T-bet和IFN-γ先下降后上升，Th2细胞的GATA-3和IL-4均呈下降趋势，且T-bet/GATA-3和IFN-γ/IL-4比值在12、24和36 h均升高；Th17细胞的RORc和IL-17A在各时间点下降，而Treg细胞的Foxp3和IL-10在各时间点升高，且RORc/Foxp3和IL-17A/IL-10比值在各时间点均变低。rPoMIF可造成家兔外周血单个核细胞的Th1/Th2和Th17/Treg平衡分别向Th1和Treg偏移。     

加味葛根芩连汤对湿热泄泻仔猪肠道炎症和损伤修复的作用

通过用加味葛根芩连汤治疗仔猪的湿热泄泻,探讨其对湿热泄泻仔猪肠道的修复作用。选取8~15日龄未断奶仔猪（大白×长白）30头,其中健康仔猪6头,为对照组;有粪色黄褐而臭、小便短赤、舌质红等症状的泄泻仔猪24头,分为湿热泄泻组、加味葛根芩连汤低剂量组、加味葛根芩连汤中剂量组和加味葛根芩连汤高剂量组,每组6头。对照组和湿热泄泻组仔猪灌服生理盐水,药物组仔猪灌服加味葛根芩连汤（按生药量,低、中、高剂量组药物添加量分别为2.5、5.0和10.0 g·d^-1）,连续5 d。在服药的第0、3、5天记录各组仔猪的粪便评分。取对照组、湿热泄泻组、加味葛根芩连汤中剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠和结肠进行组织切片和H.E.染色,取十二指肠进行增殖性细胞核抗原（PCNA）免疫组化染色;用荧光定量PCR检测对照组、湿热泄泻组、加味葛根芩连汤中剂量组仔猪空肠TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达量变化。湿热泄泻严重破坏了仔猪的十二指肠、空肠、回肠和结肠结构,尤其是十二指肠和空肠,十二指肠隐窝处PCNA表达量显著升高（P<0.05）。与对照组相比,湿热泄泻组仔猪空肠TLR4（P<0.05）、TNF-α（P<0.01）、IL-1β（P<0.01）和IL-6（P<0.05）mRNA表达量显著升高。相比于湿热泄泻组,加味葛根芩连汤显著降低了仔猪的粪便评分（P<0.05）。中剂量加味葛根芩连汤组仔猪的小肠和结肠的组织结构得到显著改善,十二指肠的肠腔中有不断脱落的绒毛团,绒毛中的PCNA表达量极显著升高（P<0.01）。与湿热泄泻组相比,加味葛根芩连汤中剂量组空肠TLR4（P<0.05）、TNF-α（P<0.01）、IL-1β（P<0.01）和IL-6（P<0.05）mRNA表达量显著降低。综上表明,加味葛根芩连汤可通过促进隐窝干细胞的增殖和降低炎症反应对湿热泄泻造成的仔猪肠道损伤进行修复。     

β防御素124沉默通过p38MAPK/AP1通路调控山羊附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达

旨在研究山羊β防御素124（goat beta-defensin 124,gBD124）沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFP&Puro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达（P<0.05）,显著增加了RASA1基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达（P<0.05）;gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达（P<0.05）,下调了CCL5和IL-1α基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度（P<0.05）。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度（P<0.05）。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。     

不同来源传染性支气管炎病毒诱导SPF鸡发病的免疫机制研究

试验旨在探讨不同来源的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)诱导SPF鸡发病的免疫机制。选用140只1日龄SPF白来航鸡,随机分为4组,3组攻毒组通过滴鼻点眼途径分别接种鸡源IBV强毒株、鸡源IBV弱毒株和野鸡源IBV毒株3个毒株,对照组以同种方式接种等量灭菌的磷酸盐缓冲液。在感染后12 h、36 h、72 h、7 d和14 d,每组随机选取5只进行剖检,并分别采集法氏囊、肾脏和气管组织,剩余鸡用于观察临床症状、发病及死亡情况。应用实时荧光定量PCR检测攻毒后不同时间点采集的各组织中IBV的病毒载量、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及部分细胞因子(白细胞介素(interleukin,IL)和干扰素(interferon,IFN))表达量的变化。结果显示,感染不同来源IBV毒株之后仅鸡源IBV强毒株感染组SPF鸡出现抑郁、翅膀下垂、甩头等典型的临床症状,且在感染后5~10 d共有7只死亡,死亡率为20%。病理剖检发现,感染鸡源IBV强毒株的鸡肾脏肿大、尿酸盐沉积和有花斑样病变,而感染野鸡源IBV毒株、鸡源IBV弱毒株和对照组的鸡无明显的眼观病变。实时荧光定量PCR结果显示,在鸡源IBV强毒株组的法氏囊、肾脏和气管3个组织中均检测到病毒。对照组和野鸡源IBV毒株组中均未检测到病毒,鸡源IBV弱毒株组只在部分组织中检测到病毒。在感染后72 h,鸡源IBV强毒株组与其他各组相比,TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15基因在法氏囊中的表达量均显著升高(P<0.05),IL-6和IFN-β参与更强烈的抗病毒免疫反应;在感染后7 d,鸡源IBV弱毒株组与其他各组相比,肾脏中TLR2、TLR3、TLR15、TLR21、IL-6和IL-18基因表达量均显著升高(P<0.05)。野鸡源IBV感染后36 h法氏囊组织中IFN-γ基因表达量显著上调(P<0.05)。综上所述,3个IBV毒株中仅鸡源IBV强毒感染引起SPF鸡典型临床发病症状与可视组织病变,且可提高SPF鸡组织中免疫相关因子的基因表达量。本研究结果揭示,不同来源的IBV对SPF鸡的不同致病性与其感染诱导的免疫反应不同有关。     

蜂胶对细菌脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮细胞炎症相关基因mRNA转录水平和紧密连接蛋白的影响

本试验旨在研究中国蜂胶乙醇提取物（ethanol extract of Chinese propolis，EECP）对细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下体外培养奶牛乳腺上皮细胞炎症相关基因mRNA转录水平和紧密连接渗透性的影响。EECP中总酚酸和总黄酮含量测定采用福林酚法和硝酸铝法，并建立LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，MAC-T）炎症模型，采用CCK-8法测定EECP对MAC-T相对增殖率的影响，利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）评估EECP对LPS诱导的MAC-T细胞炎症相关因子（IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β）相对mRNA转录水平；以及对紧密连接蛋白（occludin、ZO-1）相对mRNA转录水平进行检测，并进一步利用免疫荧光技术对紧密连接膜蛋白进行定位，确定EECP对LPS诱导MAC-T细胞炎症紧密连接渗透性的影响。结果显示：EECP中总酚酸含量为106.35 mg没食子酸当量（GAE）·g^-1、总黄酮含量为320.85 mg芦丁当量（RE）·g^-1；CCK-8结果显示EECP的安全浓度为0~15 μg·mL^-1，并可有效提高LPS刺激下MAC-T的活力；LPS刺激显著增加了细胞炎症相关因子IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β mRNA的转录量（P<0.001）；但2.5~15.0 μg·mL^-1 EECP预处理显著降低了IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β mRNA的转录量；与此类似，LPS刺激显著抑制了紧密连接蛋白基因（occludin、ZO-1）mRNA的转录量（P<0.01），而EECP预处理后紧密连接蛋白基因（occludin和ZO-1）mRNA的转录量显著增加（P<0.05）；免疫荧光染色试验也证实EECP能通过上调紧密连接蛋白（occludin、ZO-1）的表达，缓解LPS诱导的乳腺上皮细胞屏障功能紊乱。该结果证实，EECP对细菌脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症具有良好的保护作用，这为利用中国蜂胶预防奶牛乳腺炎提供了试验基础。     

猪舍细颗粒物促进猪原代肺泡巨噬细胞向M1极化

旨在研究猪舍细颗粒物（PM_2.5）对猪原代肺泡巨噬细胞（PAMs）精氨酸代谢、炎症因子表达和极化标志物表达的影响。利用支气管肺泡灌洗方法,体外分离PAMs,细胞纯化后,利用Diff-quik染色和F4/80标记鉴定PAMs,并测定细胞活力。将纯化培养的PAMs分为对照组和PM_2.5处理组（50 μg·mL^-1）,继续培养4、8和12 h,测定细胞活力,收集细胞上清测定一氧化氮（NO）的含量,裂解PAMs测定精氨酸酶的活性,并采用RT-PCR检测PAMs炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-10以及M1、M2型巨噬细胞标志物CD80和CD206的表达水平。结果显示,通过支气管肺泡灌洗方法成功分离培养了PAMs,并发现PAMs的细胞活力随着培养时间的延长逐渐降低（P<0.05）。PM_2.5处理PAMs,显著提高了细胞上清中NO含量（P<0.05）,显著降低了细胞精氨酸酶的活性（P<0.01）,并显著提高了细胞炎症因子IL-1β和TNF-α mRNA表达水平（P<0.01）,降低了IL-10 mRNA表达水平（P<0.05）。另外,PM_2.5处理PAMs早期,显著提高了CD80 mRNA表达水平（P<0.01）,在后期显著降低CD206 mRNA表达水平（P<0.01）。综上表明,猪舍PM_2.5促进了PAMs向M1表型极化,促进了炎症的发展。     

CTSD对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制及功能分析

旨在分析组织蛋白酶D（cathepsin D, CTSD）对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制并初步探究其对产羔性状的影响机理。本研究以36周龄、健康、多胎黔北麻羊母羊（n=5）为研究对象,屠宰后采集卵巢组织分离培养卵泡颗粒细胞,构建真核表达载体pEGFP-N3-CTSD,将其导入细胞后在转录与翻译水平验证真核表达效率;通过CCK-8法检测在不同时间段内重组质粒对颗粒细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测重组质粒对颗粒细胞凋亡及周期的影响;随后使用RT-qPCR法在细胞水平检测重组质粒对细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3,细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E mRNA表达水平的影响,最后,以多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA为功能基因,在转录与翻译水平上验证重组质粒对其mRNA与蛋白表达的影响。双酶切及测序结果证实,黔北麻羊CTSD基因真核表达载体pEGFP-N3-CTSD构建成功,且在转录与翻译水平极显著上调CTSD在颗粒细胞中的表达（P<0.01）;细胞增殖检测结果表明,颗粒细胞中上调CTSD后能够抑制细胞的增殖,其中在12、24、48、72 h对细胞增殖的抑制效率达到极显著（P<0.01）;细胞凋亡检测结果表明,CTSD的过表达能够极显著促进颗粒细胞的凋亡（P<0.01）,且能够显著下调细胞抗凋亡基因Bcl-2的表达（P<0.05）,极显著上调细胞促凋亡相关基因Bax、Caspase-3的表达（P<0.01）;此外,细胞周期检测发现,pEGFP-N3-CTSD在转染后能够极显著上调G0/G1期与G2/M期的细胞数量（P<0.01）,极显著下调S期细胞数量（P<0.01）,同时能够极显著提高细胞周期相关因子Cyclin A1的表达（P<0.01）,极显著降低Cyclin D2的表达（P<0.01）。RT-qPCR及Western blot检测结果表明,在颗粒细胞中上调CTSD后,能够极显著的下调多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA在转录和翻译水平中的表达（P<0.01）。本研究发现,CTSD的高表达能抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,改变颗粒细胞的周期进程;还能改变细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3与细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E的表达;同时也能够极显著降低颗粒细胞中多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA的表达量（P<0.01）。这提示,CTSD可能通过改变细胞水平相关因子的表达量来调控颗粒细胞的生物学行为以及影响山羊多胎性状候选基因的表达进而间接的成为影响山羊产羔性状的重要因子,本研究为进一步探明CTSD对山羊产羔性状调控机理及对颗粒细胞的影响机制奠定基础。     

白藜芦醇对热应激诱导的山羊小肠上皮细胞炎性反应调节作用的研究

本试验旨在探究白藜芦醇对热应激（HS）诱导的山羊小肠上皮细胞炎性因子转录的影响。采用生长良好的第4代山羊小肠上皮细胞（GIE细胞）,分为空白对照组（37℃）、热应激组（42℃）、42℃热应激加白藜芦醇组（5、15、30 μmol·L^-1）;加药预处理6 h后进行热应激处理6 h。通过CCK-8法检测白藜芦醇细胞毒性;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白藜芦醇对热应激诱导的细胞因子分泌的影响;采用生化法检测白藜芦醇对热应激诱导的GIE细胞抗氧化性能的影响;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测白藜芦醇对热应激诱导的GIE细胞HSP70、IL-1β、TNF-α、IL-8和NF-κB基因转录的影响。结果显示：不同浓度（5、15、30 μmol·L^-1）的白藜芦醇可不同程度地提高热应激诱导的GIE细胞GSH-Px、SOD及T-AOC活性,极显著降低脂质过氧化物MDA含量（P<0.01）;不同浓度（5、15、30 μmol·L^-1）的白藜芦醇能不同程度地抑制热应激诱导的GIE细胞IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌,并极显著降低炎性模型细胞IL-1β、TNF-α、IL-8、HSP70和NF-κB的基因转录水平（P<0.01）。结果提示,白藜芦醇可调节热应激诱导GIE细胞炎性模型中HSP70基因表达和炎症因子的产生及表达,促进抗氧化酶活力,具有显著的抗炎活性,其抑炎作用可能与抑制NF-κB信号通路相关。     

术苦芩总多糖对湿热泄泻仔猪肠道菌群和免疫功能的影响

旨在探究术苦芩总多糖(ZKQPs)对湿热泄泻仔猪肠道菌群和免疫功能的影响。通过HPLC分析ZKQPs的单糖组成,体外抑菌试验研究ZKQPs体外对常见肠道致病菌的直接影响,同时建立仔猪腹泻模型,用白头翁散(PP)及3种剂量的ZKQPs (25、50和75 mg·kg^-1)治疗腹泻仔猪,治疗结束后,收集小肠各段组织、盲肠内容物,对菌落进行鉴定与计数;通过16S rDNA高通量测序分析肠道菌群的变化,测定小肠免疫相关细胞因子mRNA表达。结果显示:ZKQPs一级结构主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖构成。在体外试验中,大肠杆菌、沙门菌、猪源产气荚膜梭菌肠道常见有害菌对ZKQPs敏感,并在一定范围内呈现浓度依赖性。动物试验中,ZKQPs有效促进了腹泻仔猪肠道乳酸杆菌的生长,对致病大肠杆菌生长有较强的抑制作用,其中,50 mg·kg^-1ZKQPs影响最为显著。16S rDNA高通量测序结果表明,ZKQPs调节了腹泻仔猪菌群Alpha多样性,对肠道菌群在纲和属水平上有显著影响,腹泻仔猪芽胞杆菌纲、乳酸杆菌属相对丰度显著下降,梭菌纲相对丰度显著上升;ZKQPs治疗后芽胞杆菌纲、乳酸杆菌属相对丰度均显著上升且高于正常值,梭菌纲相对丰度极显著下降,显著改善了腹泻仔猪肠道菌群结构。仔猪腹泻时,小肠各段Th1细胞因子IL-2 mRNA水平上升(P<0.01),Th2细胞因子IL-4、IL-5 mRNA水平均下降;ZKQPs治疗后,腹泻仔猪小肠各段IL-2 mRNA水平下降,IL-4、IL-5 mRNA水平普遍上升,且不同细胞因子mRNA水平在小肠不同位置变化有所差异,50和75 mg·kg^-1ZKQPs治疗后对其影响最为显著,综合分析50 mg·kg^-1ZKQPs治疗腹泻仔猪对细胞因子mRNA水平影响最大。综上表明,ZKQPs在体外对常见肠道致病菌生长具有良好的抑制作用,可以改变腹泻仔猪肠道微生物群的丰富度和多样性,提高乳酸杆菌属的相对丰度,并改善菌群结构,同时调节肠道免疫反应,有效增强了仔猪抗腹泻能力。     

HMGB1与日本血吸虫病肝炎症和纤维化的相关性分析

旨在探究高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1,HMGB1）与日本血吸虫病肝炎症和纤维化的相关性,本研究将BALB/c小鼠随机分为空白对照组（n＝10）,感染后4周组、6周组和HMGB1抑制剂组（n＝5）,进行血常规及生化检测,观察肝病理学及Masson染色情况、荧光定量PCR检测HMGB1、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ、α-SMA、Col1α1、TGF-β1、Smad2和Smad3的转录水平。结果显示：感染后4周,小鼠谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、肝组织HMGB1、α-SMA、TGF-β1、IL-6和 TNF-α的转录水平均显著或极显著升高（P<0.05或P < 0.01）;感染后6周,小鼠WBC、Neu、Mon、Eos、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和ALT极显著升高（P<0.01）,肝组织HMGB1、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ、α-SMA、Col1α1、TGF-β1、Smad2和Smad3的转录水平均显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01）;感染后6周小鼠肝虫卵聚积处伴有炎性细胞浸润和胶原纤维增生;HMGB1抑制剂可显著降低小鼠血清ALT值和肝组织HMGB1、α-SMA、TGF-β1、IL-6和TNF-α的转录水平（P<0.05）。综上表明,HMGB1与日本血吸虫病肝炎症和纤维化具有一定相关性。