橡胶树5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的克隆及其响应非生物胁迫的表达分析

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)是植物合成芳香族氨基酸的一个重要酶,与许多抗逆相关的次生代谢物的合成有关.本研究利用RACE技术从橡胶树热研7-33-97中获得了全长为2025 bp的HbEPSPS基因cDNA序列,开放阅读框为1572 bp,编码523个氨基酸;使用ProtParam tool预测该基因编码的蛋白质分子量为56.01u,等电点(pI)为7.91.该基因由8个外显子和7个内含子构成,全长4600 bp.实时荧光定量PCR结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树叶片、皮、花、胶乳和胚中均表达,其中以叶片中的表达量为最高.激素、干旱、盐和低温等非生物胁迫都能诱导HbEPSPS基因表达量上调,其中茉莉酸甲酯、乙烯和PEG的上调作用最为显著.橡胶树HbEPSPS基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达调控研究将为橡胶树抗逆相关的研究提供理论依据.     

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT的克隆与表达分析

以白叶1号为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT（GenBank登录号：KJ652972）。CsPPT完整ORF长度为1β227βbp,编码408个氨基酸,蛋白分子量为44.7βkDa,理论等电点为10.16;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;建立了茶树CsPPT蛋白的系统发育树;磷酸化修饰预测该蛋白质多肽链中共有26个磷酸化位点;TMHMM预测表明CsPPT蛋白为跨膜蛋白;亚细胞定位发现,CsPPT蛋白定位于叶绿体上,推测CsPPT蛋白可能定位于叶绿体膜上。荧光定量PCR结果表明CsPPT基因在茶树花中表达量最高,其次为芽、叶和嫩茎,根中最低。     

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子CsPPT2基因的克隆和分析

以茶树(Camellia sinensis)白叶1号为材料,应用RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子家族一个基因CsPPT2的c DNA序列,并与茶树体内另一个磷酸烯醇式丙酮酸转运子家族的基因CsPPT1在不同时期和不同部位的表达进行比较。CsPPT2的c DNA全长1 469 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 218 bp,编码406个氨基酸。通过生物学信息分析表明,CSPPT2蛋白分子量为44.6 k D,理论等电点为9.90,CsPPT2有6个跨膜区,属于疏水性叶绿体跨膜蛋白。聚类分析显示,茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子家族分为2个亚组,而CsPPT1与CsPPT2属于不同亚组。荧光定量结果分析表明,两个基因可能在茶树体内功能不同,CsPPT2在所考察的组织中均有表达,且在根和成熟叶片中表达量远大于CsPPT1;CsPPT1在茎和复绿前的幼嫩芽叶中表达量高于CsPPT2。在白化期起始时CsPPT2有短暂的升高,但伴随白化受到较大的抑制,表明CsPPT2的表达抑制可能是白叶1号低儿茶素高氨基酸品质形成的关键因素。     

橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因HbPPC1的克隆和表达分析

根据橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的部分序列设计引物,运用RT-PCR和RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为HbPPC1,长度3 025 bp,包含5′-UTR 34 bp,3′-UTR 93 bp,开放阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸。预测HbPPC1分子量为110.34 ku,理论等电点为6.09。HbPPC1具有C3型PEPC的结构特征,其N端第9~17位残基是可逆磷酸化的不变序列-X-X-SIDAQLR,C端倒数第4位残基为谷氨酰胺(Q),第774位残基为丙氨酸(A)。HbPPC1与5条大戟科植物的PEPC序列(其中木薯2条、蓖麻2条、麻风树1条)的同源性达到95％。系统进化分析表明,HbPPC1与这5条序列聚在同一个进化支中。HbPPC1包含2个酶活性位点和7种类型的Motifs,二级结构以由α-螺旋和无规则卷曲为主。Real-time RT-PCR结果表明,HbPPC1在橡胶树胶乳、叶片、树皮和花中均表达,在胶乳中的表达量最高;胶乳HbPPC1的表达受乙烯利刺激影响,在乙烯利刺激4~72 h后胶乳HbPPC1表达明显下调,表明HbPPC1在胶乳pH值调控中起重要作用。本研究结果为HbPPC1的功能研究提供理论依据。     

花生甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆与序列分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的功能及作用机理在模式植物拟南芥中已经得到了较为充分的研究,但是在花生中还没有关于这类基因的报道,其功能也没有得到证实。本研究通过Bioedit软件在花生cDNA文库中找到了6个可能编码GPAT蛋白的基因片段,其中有3个基因没有包含完整的开放阅读框。我们通过5’-和3＇-RACERT—PCR对这3个基因的全长进行了克隆,得到了包含完整读码框的基因序列,并将序列在GenBank上注册,同时对得到的序列进行了初步分析。     

胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶Pn4CL基因的克隆及表达分析

根据胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL）基因的部分序列设计引物,运用RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为Pn4cl,长度2130 bp,开放阅读框1638 bp,编码545个氨基酸。预测Pn4CL分子量为59.57 kDa,理论等电点为5.70。该基因含有AMP-binding（AMP-binding enzyme）、CaiC[Acyl-CoA synthetase (AMP-forming) /AMP-acid ligaseⅡ]、PLN02246、AFD-class I等结合域,具有植物4CL所共有的保守结构域。系统进化分析表明,Pn4CL与北细辛的同源性最高,同时与木兰分支类植物的4CL聚类在一起,与菊分支的进化距离较近,与蔷薇分支的进化距离较远。亚细胞定位表明,该蛋白定位在细胞膜上。Real-time RT-PCR结果表明,该基因受外援激素SA和MeJA诱导表达,同时接种辣椒疫霉菌后,Pn4CL基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象,并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为Pn4CL的功能研究提供了理论依据。     

基于单分子实时测序的油莎豆全长转录组分析

油莎豆以其适应性广、产量和含油量高而成为我国的新型油料作物.为解析油莎豆的遗传基础,服务于育种和分子生物学研究,采用单分子实时测序技术构建了油莎豆高质量的全长转录组,混合样本的组织来源包括块茎、匍匐茎、根、芽、叶片、叶鞘、花、花茎等.研究基于23.20 Gb高质量的原始数据提取获得环形一致序列319568条,其平均长度...     

油莎豆块茎萌发特性的初步研究

研究不同浸泡温度、环境温度、基质及块茎大小的处理对油莎豆块茎萌发的影响,并初步分析不同来源地的油莎豆块茎萌发及幼苗生长特性。结果表明：35 ℃温水浸种,有效改善了油莎豆块茎的透水性,并显著提高块茎萌发率;环境温度为35~42 ℃时,有利于油莎豆块茎发芽,20 ℃以下的低温不利于块茎的萌发;透气性较好的沙壤土适宜油莎豆的种植,而黏质壤土则相反;在选种育苗时,应优选大粒饱满的油莎豆块茎用于催芽育苗;此外引种我国不同地区的油莎豆品种幼苗长势与地理纬度无相关规律。据上述试验结果,并结合我国海南省的环境条件,应尽快在海南进行油莎豆的南繁育种及栽培等方面的研究。     

油莎豆的研究现状及展望

介绍了油莎豆抗逆性强、播种期长、产量高、块茎含油率高等生物性状,以及能做绿肥、保健食用油、保健医药、饲料等用途,并对油莎豆未来大面积种植推广进行了展望。     

油莎豆块茎油脂积累相关基因CeWRI1的克隆与功能分析

起源于非洲的油莎豆是迄今唯一已知在块茎中高水平积累油脂的新型草本油料作物。基于我国当前食用植物油和生物柴油原料供给紧张的局面,挖掘参与油莎豆块茎油脂积累的关键基因具有重要的理论意义和应用价值。WRI1（WRINKLED1）隶属于AP2/ERF转录因子家族,是一类被证实在油料种子发育过程中控制碳源由糖向油分配的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从油莎豆的块茎中分离到一个WRI1同源基因（CeWRI1）,该基因的编码区为1116 bp,预测编码371 AA,其理论分子量为41.58 kDa,等电点为5.76,总平均疏水指数为-0.750,不稳定系数为60.75,细胞核定位,这与其转录调控功能是一致的。与拟南芥WRI1类似,序列分析显示CeWRI1含有2个保守的AP2结构域（PF00847）、1个VYL基序和1个14-3-3/BPM结合基序;相比AP2结构域和N端,其C端序列的变异较大,但包含与蛋白降解相关的PEST基序。qRT-PCR分析显示,CeWRI1在叶片、叶鞘、根、匍匐茎和块茎等主要组织中都有表达,且其在起始期、膨大初期、膨大中期、膨大晚期和成熟期等不同发育时期块茎中呈现先降后升的J型表达趋势,表达丰度最高的为成熟期,最低是膨大中期,这与油脂的积累模式大体一致。在烟草中的功能分析显示,CeWRI1的异源瞬时过表达可显著提高叶片的油脂（甘油三酯）含量,这进一步证实该基因具有油脂调控功能。上述结果表明CeWRI1是调控油莎豆块茎高水平积累油脂的关键基因之一,这不仅为进一步揭示油莎豆块茎油脂积累的调控机制奠定了坚实的基础,也为后期的品种改良提供了宝贵的基因资源。     

油莎豆幼苗应对盐碱胁迫的光合生理响应机制

对油莎豆幼苗在不同浓度盐胁迫和碱胁迫下的光合生理响应进行研究,揭示其耐盐机制以及抗盐碱能力阈值,为油莎豆在新疆大面积种植及合理划分种植区域提供理论基础。试验选用2种中性盐（NaCl, Na₂SO₄）和2种碱性盐（NaHCO₃ , Na₂CO₃）,分别按2∶1的比例配成相应溶液进行胁迫处理,盐、碱胁迫处理低、中、高浓度分别为 80、160、320 mmol· L^-1和40、80、120 mmol· L^-1,培养于室内光温培养箱中,在出苗15 d后,测量叶绿素含量,光合参数,荧光参数等指标。结果表明：在盐、碱胁迫下随胁迫程度的增加叶绿素a含量（Chl a）、叶绿素b含量（Chl b）、总叶绿素含量（Chl T）、类胡萝卜素含量（Car）、光合速率（P_n）、气孔导度 （G_s）、蒸腾速率（T_r）呈下降趋势,最大荧光（F_m）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）、最大光化学效率（F_v/F_m）、光化学猝灭系数（qP）被抑制,非调节性能量耗散（Y(NO)）升高。其中P_n与G_s、T_r、Chl a,呈极显著正相关（P<0.01）,与Car、Chl T、F_m、ΦPSⅡ、qP（P<0.05）成显著正相关,与Y(NO)表现为显著负相关。因此油莎豆在盐、碱胁迫下光合速率下降主要与G_s、T_r、Chl a的降低有关。且油莎豆在盐碱胁迫下可通过降低G_s、T_r、叶片含水量（WC）和提高水分利用效率（WUE）以及启动热耗散机制来维持水分的供给和光合系统的动态平衡。在不同盐成分处理中表现为同浓度下碱胁迫抑制程度均大于盐胁迫。     

小麦β-酮脂酰CoA合成酶基因KCS的克隆与酵母表达

超长链脂肪酸是生物体内众多重要物质的合成底物。KCS基因编码β-酮脂酰CoA合成酶,该酶具有底物特异性,参与超长链脂肪酸延伸的缩合反应,是超长链脂肪酸合成的限速步骤。为了探究小麦KCS基因在超长链脂肪酸合成中的功能,采用同源克隆的方法从小麦(Triticum aestivum L.)中克隆出KCS基因后,利用生物信息学对其编码序列进行分析,并在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对其进行真核表达。结果表明,小麦TaKCS6基因的开放阅读框为1 287bp,编码428个氨基酸残基。结构域预测结果显示,TaKCS6蛋白含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和C末端3-酰基ACP合酶III结构域,属于KCSs蛋白家族。序列比对分析结果显示,TaKCS6氨基酸序列与拟南芥及其他植物的KCS6氨基酸序列在两个功能结构域上和活性位点保守。酵母表达结果显示,TaKCS6基因编码的蛋白参与C24以上超长链脂肪酸的延伸。     

辣椒CaDREB3基因的克隆和表达特性分析

从构建的辣椒c DNA文库中筛选阳性克隆,测序并获得辣椒CaDREB3基因,研究该基因的亚细胞定位、瞬时表达及组织表达特性,揭示CaDREB3的功能及其在植物抗逆过程中的分子机制。应用预测软件对其进行功能及生物信息学分析,利用q RT-PCR分析CaDREB3基因的瞬时表达及在不同组织中的表达特性,并以基因枪轰击洋葱表皮的方法,对CaDREB3基因进行亚细胞定位分析。结果表明,辣椒CaDREB3长度为1 997 bp,含有1071bp的完整的开放阅读框,编码357个氨基酸,含有ERF亚族的AP_2/ERF保守结构域,与西红柿(NP_001234707.1)、马铃薯(AET99101.1)及拟南芥(NP_177931.1)具有较高的氨基酸相似性,其中与西红柿的相似性最高,达83%。亚细胞定位表明该基因位于细胞核,瞬时表达表明CaDREB3可以和GCC-box结合,q RTPCR检测表明,CaDREB3基因的相对表达量在辣椒茎、叶和果实中表达量较高。实验明确了辣椒CaDREB3基因亚细胞定位信息和组织表达情况,为进一步研究其功能及分子机制提供依据。     

枇杷鲨烯合酶(Squalene synthase)基因的克隆及序列分析

鲨烯合酶(SQS)是枇杷三萜酸生物合成过程中的关键酶。以枇杷(Eriobotrya japonica L.)悬浮培养细胞为材料,采用RT-PCR和RACE方法分离得到枇杷鲨烯合酶Ej-SQS(Squalene synthase)基因的cDNA全长序列(GenBank,JQ294055),共1 775 bp,包含了5′非编码区为97 bp,开放阅读框为1 239 bp,3′非编码区为439 bp。该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含412个氨基酸)与其它植物SQS具有79%~94%同源性,包含Trans_IPPS_HH保守结构域,可能属于Isoprenoid Biosynthesis enzymes,Class 1家族。为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。     

香蕉柠檬酸合酶基因MaGCS的克隆及生物信息学分析

采用RACE-PCR的方法首次在香蕉中获得一个柠檬酸合酶基因的cDNA序列。经序列测定和Blastx比对分析表明,该cDNA全长1 885bp,编码513个氨基酸残基,具有植物柠檬酸合酶基因的特征结构域,并与其他植物来源的乙醛酸循环体的柠檬酸合酶具有很高的序列相似性,将其命名为MaGCS(Musa glyoxysomal citrate synthase),并对其进行生物信息学分析,初步预测其理化性质及功能等。