西门塔尔牛胰腺间充质干细胞原代培养及其多向分化潜能研究

旨在对西门塔尔牛胰腺间充质干细胞（pancreatic mesenchymal stem cells,PMSCs）进行原代培养并研究其体外分化潜能,为细胞疗法和组织工程学方面提供新的种子细胞。本研究从3月龄的西门塔尔牛胚胎中无菌分离胰腺组织,分别采用胶原酶消化法和组织块贴壁法分离PMSCs,进行原代培养;绘制第3代、第9代、第15代细胞生长曲线并测定群体倍增时间及克隆形成能力,采用免疫荧光检测干细胞表面标志物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD34和CD45）,RT-PCR检测干细胞细胞表面标志物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166、CD34和CD45）;染色体核型分析检测其基因稳定性,通过向成脂、成骨、成软骨和成肝样细胞诱导分化,检测其多向分化潜能。结果表明,两种方法都可成功分离出PMSCs,细胞贴壁后形态均为长梭形,漩涡状生长,生长趋势呈典型的S形;第9代细胞群体倍增时间显著低于第15代而高于第3代（P<0.01）;第9代PMSCs克隆形成率显著低于第3代而显著高于第15代（P<0.05）;免疫荧光结果表明,PMSCs特异性表达CD29、CD44、CD73和CD90,RT-PCR结果显示PMSCs特异性表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD106和CD166,未表达造血细胞表面标志物CD34和CD45,与国际细胞治疗学会组织干细胞委员会指定的MSCs表面标记物相对应;核型分析表明,PMSCs为正常二倍体（2n=60,XY）,染色体基因组未发生变异;特异性染色和RT-PCR结果表明,从西门塔尔牛体内获得的PMSCs可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和肝样细胞。本试验证实两种方法均可成功建立西门塔尔牛PMSCs体外分离培养体系,PMSCs具有活性好、增殖速度快的特点,与MSCs有相似的生物学特性和多项分化的潜能。可为组织工程学提供新的种子细胞。     

西门塔尔牛牙龈间充质干细胞的分离鉴定及诱导分化

本研究旨在建立西门塔尔牛牙龈间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）体外分离培养体系，并对其生物学特性进行探讨，为细胞治疗、再生医学等提供种子细胞。取14周龄西门塔尔牛牙龈，采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法分离GMSCs，进行体外培养和冷冻保存，测定冻存前后细胞活率，MTT检测法绘制GMSCs生长曲线；通过免疫荧光、流式细胞术和PCR等方法鉴定西门塔尔牛GMSCs特异性标记物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和STRO-1），并通过体外成脂、成骨诱导检测其多向分化潜能。结果表明，西门塔尔牛GMSCs折光性强、贴壁后呈长纺锤形；冻存前和复苏后细胞的活率检测结果显示，细胞复苏后的活率均小于冻存前的活率，但均维持在85%以上，细胞生长曲线呈典型的"S"型；免疫荧光结果显示，西门塔尔牛GMSCs表达CD29、CD105和STRO-1，不表达CD31；PCR结果显示，西门塔尔牛GMSCs表达CD44、CD73、CD90和CD166，不表达CD34和CD45；流式细胞术结果显示，西门塔尔牛GMSCs高表达CD73（99.94%）、CD90（99.87%）和CD105（99.90%），几乎不表达CD34（1.16%）和CD45（1.18%）；成脂诱导分化后，可见大小不一的脂滴，脂滴可被油红O染色，且PCR检测结果表明其表达成脂关键基因过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ（PPAR-γ）和脂蛋白酶（LPL）；成骨诱导分化后，可见被茜素红染色的矿化结节，且PCR检测结果表明其表达成骨关键基因Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）和骨桥蛋白基因（OPN）。综上，本研究成功分离出西门塔尔牛GMSCs，建立了西门塔尔牛GMSCs体外分离、培养体系，并通过成脂和成骨诱导分化证明其具有多向分化潜能，结果可为再生医学和牙齿修复等研究提供参考。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

为了在体外研究西门塔尔牛的肌肉生长发育过程并建立牛骨骼肌卫星细胞的原代细胞模型。本研究采用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化后再使用0.25%胰酶消化获得牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal satellite cell，BSSC），并利用差速贴壁法分离获得纯化后的BSSC，使用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法鉴定BSSC，使用成脂诱导剂诱导其分化为脂肪细胞，油红O染色鉴定分化后细胞的成脂能力，使用2%马血清诱导其分化为肌细胞，RT-PCR鉴定静止期PAX7基因和肌细胞的标记基因MyoG在诱导前后表达量的变化。结果发现，分离纯化得到的BSSC呈梭形或纺锤形，细胞形态饱满，折光性强，随着培养时间的延长，细胞由原来的无序生长变为有序生长；RT-PCR检测发现，BSSC表面标志基因Desmin、c-Met、Myf5和特异性标志基因PAX7均呈阳性表达；免疫荧光染色及Western blotting结果显示，PAX7和MyoD基因均呈阳性表达；成脂细胞诱导分化后被油红O大量染色并观察到大量脂滴出现；成肌细胞诱导分化后静止时期PAX7基因表达量诱导前高于诱导分化后，而成肌标记基因MyoG表达量诱导前低于诱导分化后。综上，本研究成功分离获得BSSC，并证明BSSC具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力，为体外研究西门塔尔牛肉制品调控机制提供原代细胞模型。     

绵羊胚胎肌源性干细胞的生物学特性

为研究绵羊胚胎肌源性干细胞的生物学特性,取30日龄的绵羊胚胎,采用联合酶消化法及差速贴壁法分离培养获得均质的肌源性干细胞,并对其进行一系列生物学特性检测。结果显示,绵羊肌源性干细胞能传代培养至35代以上;免疫荧光染色和RT-PCR鉴定肌源性干细胞表面标记物Sca-1、CD34、CD144和Desmin呈阳性表达;生长曲线和细胞周期结果显示绵羊肌源性干细胞具有较强自我更新能力;通过不同的诱导方法可以将肌源性干细胞成功地诱导为肝样细胞和胰岛样细胞,Schiff染色和双硫腙染色均呈阳性,RT-PCR检测肝样细胞特异性标记物AFP和ALB以及胰岛样细胞特异性标记物Insulin均呈阳性表达,进一步证明了其诱导分化潜能。结果表明,本试验成功地分离培养获得了均质并具有较强自我更新潜能的绵羊肌源性干细胞,这种干细胞具有向肝样细胞和胰岛样细胞分化的潜能,这为临床治疗提供了潜在的理论基础和大量的种子细胞。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

本研究对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养、诱导分化和鉴定,采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,观察卫星细胞及诱导分化后肌管的形态结构,并利用标志基因的反转录PCR（RT-PCR）和免疫荧光染色方法对分化前后细胞进行鉴定。结果显示,分离出的肌卫星细胞呈梭形生长,生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,纯化后的肌卫星细胞纯度大于93%;诱导分化后,卫星细胞融合生长,形成的肌管状态良好,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究建立了一套从牛肌肉组织中分离和鉴定肌卫星细胞的方法,可以为肌肉的发育分化和肉牛肉质改良研究提供良好的细胞模型。     

体外诱导牛BMSC向上皮样细胞分化的研究

为培育转基因肉牛提供种子细胞以及进一步丰富牛骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)的多向分化潜能,利用细胞免疫荧光染色和分子生物学方法,初步探讨表皮生长因子和胰岛素体外诱导牛BMSC向上皮样细胞分化的可能性。利用含细胞因子的诱导液对纯化稳定的P4代牛BMSC进行体外诱导,并对诱导后的细胞进行细胞角蛋白18的细胞免疫荧光观察和细胞角蛋白19的RT-PCR鉴定。结果表明,诱导后细胞经细胞角蛋白18免疫荧光染色后出现明显的荧光。RT-PCR结果显示诱导分化后细胞角蛋白19基因在细胞中表达。因此,在体外,表皮生长因子和胰岛素可诱导牛BMSC初步分化为上皮样细胞。     

马脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性试验

为马的关节炎、肌腱和韧带损伤的临床治疗提供种子细胞,本试验通过采集马颈部脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离脂肪间充质干细胞,并进行传代培养;绘制细胞生长曲线、测定细胞群体倍增时间;通过流式细胞术检测P3代细胞表面标记物,RT-PCR法扩增细胞表面标记物目的基因片段;油红O和茜素红染色法测定脂肪间充质干细胞的成脂和成骨诱导分化能力。结果发现:马脂肪间充质干细胞体外培养条件下呈长梭形和典型的旋涡状,生长状态良好、折光性强;经测定细胞生长曲线呈典型的"S"型,符合Logistic生长曲线规律;P3、P6和P9代细胞群体倍增时间分别为21.5 h、26 h、36 h;流式细胞术检测结果显示,P3代细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD90和CD105,不表达造血系细胞表面标志物CD45;PCR扩增得到CD44、CD90、CD105和CD73特异性目的片段;油红O和茜素红染色证明,马脂肪间充质干细胞具有成脂和成骨诱导分化能力。     

体外诱导牛骨髓间充质干细胞向乳腺样上皮细胞分化的初步研究

为培育转基因肉牛提供种子细胞及进一步丰富牛骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)的多向分化潜能,本试验利用细胞免疫荧光染色方法和分子生物学方法初步探讨在表皮生长因子、胰岛素、催产素和孕酮等条件下,体外诱导牛BMSC向乳腺样上皮细胞分化的可能性。利用不同浓度的诱导液对纯化稳定的P4、P8和P12代牛BMSC进行体外诱导,并对诱导后的细胞进行细胞免疫荧光观察和RT-PCR鉴定。结果显示,诱导后部分BMSC细胞呈多角形,而不再呈明显的梭形和纺锤形,经细胞角蛋白18免疫荧光染色后出现明显的荧光。P4代牛BMSC在诱导液Ⅱ的诱导作用下分化效果显著。RT-PCR结果显示,诱导分化后细胞角蛋白19基因、β-酪蛋白基因及αs1-酪蛋白基因在细胞中表达。因此,在体外,多因子联合诱导可使牛BMSC初步分化为乳腺样上皮细胞并且在诱导液Ⅱ的联合诱导下分化作用最明显。     

盘羊脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化

试验旨在研究野生盘羊脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）的分离、培养及体外多向分化潜能等生物学特性。取盘羊分娩后的新生雄性胎儿脐带,采用组织块培养法分离盘羊UC-MSCs后进行体外培养,并对UC-MSCs进行成骨、成软骨和成脂诱导分化,检测其多向分化潜能。结果显示,应用组织块培养法获得的盘羊UC-MSCs具有UC-MSCs特有的呈簇、成纤维状的特性,细胞呈"S"型曲线生长,细胞的倍增时间平均为33.50 h,且可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞分化。诱导分化特异性染色结果表明,野生盘羊UC-MSCs经诱导后的成骨细胞经茜素红S染色呈现典型的橙红色钙沉积物聚集,成软骨细胞经阿利新蓝染色呈现蓝色的软骨基质,成脂细胞经油红O染色呈现深红色的脂滴。实时荧光定量PCR检测结果发现,随着诱导时间的延长,成骨分化的细胞中骨内γ-羧基谷氨酸蛋白（BGLAP）、骨桥蛋白基因（OPN）、Runt相关转录因子2（RUNX2）基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;成软骨分化的细胞中光蛋白聚糖（LUM）基因的表达量明显增加,而双糖链蛋白多糖（BGN）和Y染色体性别决定区基因盒9（SOX9）基因表达量极显著提高（P<0.01）;成脂分化的细胞中脂蛋白酶（LPL）和过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPAR-γ）基因的相对表达量极显著上升（P<0.01）。试验结果表明,用盘羊胎盘附带的脐带组织可以分离到盘羊UC-MSCs,且分离到的UC-MSCs具有分化为成骨细胞、成软骨细胞及成脂细胞等多向分化潜能。     

体外血脑屏障模型的构建及致脑膜炎粪肠球菌对其的影响

试验旨在探索致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障功能的影响，寻求稳定的构建体外血脑屏障损伤模型的方法。选用1周龄ICR小鼠进行原代脑微血管内皮细胞（BMEC）分离并通过BMEC特有的凝血因子Ⅷ（coagulation factor Ⅷ，Factor Ⅷ）进行荧光标记，鉴定分离的细胞并判定分离率。选用1~3日龄ICR小鼠分离星形胶质细胞并通过其特有的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）对进行荧光标记，鉴定分离的细胞并判定分离率。将原代细胞传至3代，用Transwell二维小孔分别构建单层BMEC和BMEC与星形胶质细胞共培养的血脑屏障模型。选用致脑膜炎粪肠球菌、非致脑膜炎粪肠球菌和大肠杆菌DH5α感受态细胞分别与构建的体外血脑屏障模型共培养，评估致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障模型的穿透性。通过4 h渗透试验、荧光素钠通透性试验和血脑屏障损伤相关标志基因基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达量的检测，评估致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障模型的影响。结果显示，试验成功分离到BMEC和星形胶质细胞，纯度分别达90%和95%以上。细菌穿透试验结果显示，所选的3株细菌只有致脑膜炎粪肠球菌可穿越体外血脑屏障模型。4 h渗透试验和荧光素钠通透性试验结果显示，共培养模型优于单层BMEC模型。与其他组相比，构建的体外血脑屏障与致脑膜炎粪肠球菌共培养组荧光素钠的穿透力更高，MMP-2基因的表达量明显上升。综上，BMEC与星形胶质细胞共培养的模型优于单层BMEC模型，致脑膜炎粪肠球菌可穿越体外血脑屏障模型，并介导体外血脑屏障损伤，本试验结果为揭示致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障损伤机制提供了理论依据。     

高通量SNP芯片在牛体外早期胚胎染色体质量鉴定中的初步应用

旨在基于高通量SNP芯片建立一种可评估牛早期胚胎染色体质量和生产性能的方法,为胚胎牛育种提供技术支撑。本研究通过胚胎切割技术分别对荷斯坦奶牛体内囊胚(n=27)、体外囊胚(n=21)、体外2细胞胚胎(n=6)和8细胞胚胎(n=5)进行切割取样并统计发育率,其中体内囊胚组分为1/2体内胚组(切取半个胚胎)和体内滋养层(trophoblast cells, TE)组(切取体内胚胎少量TE),体外囊胚组、体外2和8细胞胚胎分别为体外TE组(切取体外胚胎少量TE)、体外2细胞(切取体外2细胞胚胎的1个卵裂球)和8细胞组(切取体外8细胞胚胎的1个卵裂球)。切割取样后进行全基因组扩增(whole-genome amplification, WGA),对扩增成功且DNA量大于1 000 ng的样品进行SNP芯片检测,芯片检出率大于90%的进行生产性能评估,低于90%的进行染色体片段缺失分析和数据填充。结果显示：1)切割部分TE后,体内TE组剩余部分和体外TE组剩余部分继续培养24 h后的发育率分别为(94.4±5.6)%和(90.5±6.6)%,而1/2体内胚组剩余部分的发育率显著降低,仅为(22....     

不同种类脂肪酸对延边黄牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响

试验旨在探究用同一浓度不同种类的脂肪酸单体（油酸、硬脂酸、棕榈油酸及棕榈酸）处理延边黄牛骨骼肌卫星细胞（BSC）,研究其对脂肪生成相关基因表达及脂滴形成的影响。从18月龄延边黄牛半膜肌中分离提取骨骼肌卫星细胞进行体外培养,在分化培养基中分别添加100 μmol/L油酸（OA）、硬脂酸（SA）、棕榈油酸（POA）和棕榈酸（PA）培养96 h,油红O染色观察脂滴生成情况,并利用实时荧光定量PCR法检测与脂肪生成相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、固醇调节原件结合蛋白1（SREBP1）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）、CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）的表达。油红O染色结果显示,与对照组相比,所有的脂肪酸处理组细胞均有脂滴形成,油酸和棕榈油酸处理组相对于棕榈酸和硬脂酸处理组在肌管内形成的脂滴数量更多,且脂滴的形态较大。实时荧光定量PCR结果显示,在延边黄牛骨骼肌卫星细胞中添加油酸和棕榈油酸等不饱和脂肪酸增加了与脂肪合成相关基因PPARγ、SREBP1、C/EBPα的表达,抑制了SCD基因的表达;添加饱和脂肪酸（硬脂酸和棕榈酸）则在促进PPARγ、SREBP1、C/EBPα基因表达的同时也显著增加了SCD基因的表达（P < 0.05）。结果表明,添加脂肪酸可以诱导延边黄牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞转分化。     

不同粒度猫尾草对羔羊体外发酵特性和微生物数量的影响

通过Rusitec-s体外发酵系统研究不同粒度猫尾草对羔羊体外发酵参数与微生物数量的影响,选取6种不同粒度(1.00、2.36、3.35、4.75、8.00和12.50 mm)的猫尾草作为试验饲粮的纤维来源,按照猫尾草的粒度将试验分为6个处理组,每个处理4个重复,利用Rusitec-s型人工瘤胃模拟装置进行48 h体外发酵,测定养分降解率、发酵参数及发酵液中6种微生物菌群的拷贝数。结果表明：与其他处理组相比,2.36 mm组显著提高了体外中性洗涤纤维降解率(IVNDFD)、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸摩尔比和溶纤维丁酸弧菌(B. f)数量(P<0.05),且显著降低总产甲烷菌(TMe)数量(P<0.05)。总菌(TB)与氨态氮(NH3-N)浓度、乙酸摩尔比呈正相关(R²=0.84,P=0.038;R²=0.88,P=0.021);B. f数量与丙酸摩尔比呈正相关(R²=0.82,P=0.045),且与pH呈负相关(R²=-0.98,P=0.001);TMe数量与体外粗蛋白质降解率(IVCP...     

牛体外胚胎冷冻保存的研究进展

体外胚胎冷冻保存技术是胚胎移植技术的重要组成部分,在辅助生殖技术中发挥重要作用,同时对种质资源保存、加强遗传改良和促进优质种源国际交流等方面具有重要意义。然而,体外胚胎冷冻过程中存在脂质含量过高、活性氧水平升高及机械损伤等问题,导致体外胚胎冷冻效率低,这极大地限制了体外胚胎冷冻保存技术的广泛应用。大量研究表明,通过去脂质、优化体外胚胎培养液、人工塌陷囊胚腔和优化冷冻程序等手段,可以有效提高冷冻后胚胎的存活率和发育能力。因此,本文概述了体外胚胎冷冻保存技术的研究进展和胚胎冷冻过程中存在的问题,总结了提高体外胚胎冷冻效率的方法措施,旨在为提高体外胚胎冷冻保存效率提供一定参考。