南方水稻黑条矮缩病毒一步双重RT-PCR 检测技术及其应用

 An one-step dual RT-PCR method was developed for Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV) detection from host plants and insect vector white-backed planthopper (Sogatella furcifera Horvath,Hemiptera: Delphacidae), from which two cDNA fragments of the viral genome S5 and S10 were amplified
simultaneously. Two primer pairs, S5-F1 / S5-R2 (5′-ttacaactggagaagcattaacacg-3′ / 5′-atgaggtattgcgtaactgagcc -3′) and S10-oF / S10-oR(5cgcgtcatctcaaactacag -3′ / 5′-tttgtcagcatctaaagcgc -3′), were selectedfrom 40 primer pairs based on SRBSDV genome sequences, and amplified viral S5 ORF1 fragment (819 bp) and cp gene fragment ( 682 bp), respectively. Using total RNA extracts from infected plant leaf tissue or individual planthopper adult as templates, one step RT-PCR reaction in the conditions of annealing temperature of 53℃ with the final concentrations of 240 nmol / L S5-F1 / S5-R2 and 120 nmol / L S10-oF / S10-oR generated a similar yield of two amplicons in argrose electrophoresis analysis. Sequence analysis confirmed the correct
result of the amplification. Additionally, several commercal RNA extraction kits was proven to be fit for the template preparation, and the protocol for total RNA extraction from plant leaf tissue and individual planthopper was simplified by sample grinding direct in eppendorf tube. This method can be used for SRBSDV detection of dried or 70% alcochol soaked planthopper samples stored over one month in room temprature. Key words: Southern rice black-streaked dwarf virus; Sogatella furcifera Horvath     

引起玉米粗缩病的水稻黑条矮缩病毒河南分离物的分子特征

<正>目前已报道的造成玉米粗缩病的病原有3种,分别是玉米粗缩病毒(Maize rough dwarf virus,M RDV),水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)[1]。我国于1954年在新疆和甘肃发现该病,上世纪60年代曾在中东部夏玉米区流行,至70年代以来各玉米产区已陆续发生[2],近年来在黄淮海夏玉米区特别是套播或晚春播、早夏播玉米田发生危害严重。     

南方水稻黑条矮缩病毒湖南分离物S9片段ORF序列分析

本文克隆了湖南省2011-2013年水稻的15个SRBSDV分离物S9两个基因,并测定了其核苷酸序列,序列分析与比较表明,S9两个ORF序列同源性均大于99.5%。突变位点分析表明,S9编码的两个ORF有3~9个突变位点,但大部分的核酸突变为无义突变。系统发育分析表明,S9编码的两个ORF高度同源,处于相同的的系统发育分支。     

水稻黑条矮缩病毒江苏玉米分离物全基因组序列及进化分析

 利用RT-PCR从江苏玉米上克隆水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的全基因组,其基因组10个片段核苷酸数目和蛋白编码情况与已报道的RBSDV分离物基本一致。 基因组的序列一致性分析和系统进化树表明,RBSDV基因组片段间存在频繁的RNA重排现象;江苏玉米分离物(JS)与湖北玉米分离物(HuB)和河北小麦分离物(HeB)的整体亲缘关系较近,而与安徽分离物(AH-MX8)的整体亲缘关系最远。综合本研究及前人对S8 和S10的研究,RBSDV基因组不同片段的进化中RNA重组的作用不同: S1、S2和S4中没有RNA重组;S3、S5、S6、S8和S10中存在低频率重组;S7 和S9存在较高频率重组,其中S7的高频率重组尤为显著。     

南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒的单抗制备及其检测应用

 用与牛血清白蛋白偶联的南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）衣壳蛋白的C端12个氨基酸多肽为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选、克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞株3F1、5G1。3F1、5G1单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6,抗体类型及亚类均为IgG1, kappa链。 Western blot分析表明,2株单克隆抗体均与SRBSDV和RBSDV的外壳蛋白亚基有特异反应。利用单克隆抗体3F1建立的dot-ELISA检测方法能准确、特异、灵敏地检测田间稻飞虱及水稻样品中的SRBSDV和RBSDV。SRBSDV和RBSDV单克隆抗体的制备及检测方法的建立为水稻黑条矮缩病的诊断、预测预报及科学防控提供了技术支撑。     

湖南省南方水稻黑条矮缩病毒分离物组分S10编码的ORF序列克隆与分析

采用RT-PCR方法扩增并克隆了2013年湖南省水稻上发生的南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice blackstreaked dwarf virus,SRBSDV)S10片段的近全长序列,采用生物信息学软件Mega、RDP和DnaSP分析其编码的开放阅读框(open reading fragment,ORF)遗传多样性。结果表明:2013年湖南省15个SRBSDV分离物S10编码的ORF序列同源性在99.5%以上,不同分离物中存在3~30个突变位点,绝大部分的核酸突变为无义突变,没有发现可能的重组。在系统发育树上,15个分离物聚类为2个分支,其中湖南汉寿的10个分离物和永州的2个分离物(HuNyz12和HuNyz29)与我国浙江分离物聚为1个亚组、湖南永州的其他3个分离物与我国南部的云南、海南等及越南的分离物聚为1个亚组。系统发育结果表明,SRBSDV随传毒介体白背飞虱迁飞从我国南部向北部扩散。     

引起玉米粗缩病的水稻黑条矮缩病毒山东分离物的分子特性

 Four isolates of Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV) were collected from the maize plants showing rough dwarf symptom in Linyi and Tai'an,Shandong province.The S10 genomic sequences of these isolates were determined and compared with those of 14 other RBSDV isolates.All of the four sequences were 1 801 base pairs (bp) long including the 5'-UTR of 21 bp and the 3'-UTR of 103 bp.They all contained an open reading frame of 1 677 bp (22-1698),encoding the coat protein (CP) of 558 amino acids.The sequences of these four RBSDV isolates and those of the major cp gene of 14 other isolates available in the GenBank were divided into two groups in the phylogenetic tree.Recombination analysis indicated that the isolate Lym2 was likely a recombinant of isolates Lym1 and Zhjs.     

我国玉米上一个水稻黑条矮缩病毒重排体的ORF序列

由水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)引起的粗缩病是我国玉米生产中的一种毁灭性病害.本文报道从山东枣庄玉米上得到的RBSDV分离物SDZZ10所有可读框(ORF)的序列.与全基因组序列已知的2个RBS-DV分离物Hbm和Zjr比较,SDZZ10的大多数ORF与Hbm相应ORF的核苷酸序列一致率更高,其蛋白与Hbm相应蛋白的氨基酸一致率也更高,但SDZZ10的ORF3,ORF4,ORF9-2和ORF10与jr相应ORF的核苷酸一致率更高,P4,P9-1和P9-2与Zjr相应蛋白的氨基酸一致率更高.根据ORF8和ORF10构建的系统进化树中,SDZZ10分别属于不同的组,说明SDZZ10是一个自然发生的重排体.     

水稻黑条矮缩病毒在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程

 水稻黑条矮缩病毒 (Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) 由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)以持久增殖型方式传播, 其编码的P9 1蛋白是形成病毒复制和子代病毒粒体装配的场所—病毒原质(viroplasm)的组分之一。为了明确RBSDV在介体昆虫体内的侵染循回过程, 本研究通过原核表达的P9 1蛋白免疫注射兔子制备P9 1抗体, 应用免疫荧光标记技术研究P9 1在饲毒后不同时期的介体灰飞虱体内的定位。共聚焦显微镜观察到饲毒后3 d, P9 1出现在介体中肠的少数上皮细胞内;饲毒后6 d, 在中肠外表的肌肉细胞分布有P9 1;饲毒后10 d, P9 1分布于中肠和后肠表面的肌肉, 同时在唾液腺也能观察到P9 1的存在。结果表明RBSDV在介体灰飞虱体内首先侵染中肠上皮细胞并复制, 随后扩散到中肠表面的肌肉细胞, 并通过环肌和纵肌扩散到中肠和后肠, 最后扩散到唾液腺。本研究首次直观地阐述了RBSDV在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程, 为有效阻断灰飞虱携带并传播病毒奠定基础。     

检测南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条的建立

由白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)传播的南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice blackstreaked dwarf virus,SRBSDV)是目前我国南方水稻上危害最严重的病毒,为开发简便、快速、准确的SRBSDV病毒检测技术和检测试剂,以感染SRBSDV的植物粗提液为免疫原,利用杂交瘤技术制备了2株抗SRBSDV的单抗(14A8和15G6),并利用制备的单抗建立了可快速、特异、灵敏地检测SRBSDV的胶体金免疫试纸条。结果表明,2株制备单抗的抗体类型及亚类均为Ig G1、kappa链,单抗腹水的间接ELISA效价均达到10~(-7);Western blot分析表明,2株单抗均与SRBSDV的外壳蛋白亚基有特异反应,而不与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)反应。以制备14A8和15G6单抗分别为捕获抗体和胶体金标记抗体,开发成能在5 min内准确、特异地检测水稻植物和白背飞虱传毒介体体内SRBSDV的胶体金免疫试纸条;灵敏度分析表明,该检测试纸条的检测水稻病叶的灵敏度达到1∶6 400倍(g/m L),检测单头携毒白背飞虱的灵敏度达到1∶51 200倍(单头/μL)。田间样品检测结果表明,该试纸条的检测结果与RT-PCR的符合率达到100%。建立的SRBSDV胶体金免疫试纸条可对南方水稻黑条矮缩病毒进行快速、特异、灵敏的诊断和检测。     

水稻新病害南方水稻黑条矮缩病发生特点及危害趋势分析

由斐济病毒属(Fijivirus)暂定新种南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)引起的水稻矮缩病,自2001年在广东省阳西县被发现以来,已迅速扩散至我国南方广大稻区。2009年,该病害在我国南部及越南晚季稻上暴发成灾,造成严重的产量损失。本文简介了该病害的症状、危害特点、病原病毒及其传毒介体特征,对其发生趋势进行了讨论,提出了以秧苗期治虫为重点的病害防控应急措施。     

影响南方水稻黑条矮缩病发生流行的因子分析

南方水稻黑条矮缩病是近年来在我国南方稻区新发生的一种重要病毒性病害。本文通过大田调查、田间试验并结合气象资料分析,表明品种抗性、种植方式、播种期、播种地段和气象因子等是影响该病发生的主要因素。不同类型水稻的发病率存在显著性差异。杂交稻发病最重,糯稻发病次之,常规稻发病最轻。同一类型的杂交稻不同品种对南方水稻黑条矮缩病的抗(耐)病性存在较大差异。‘特优161’最感病,‘华优638’最抗病。抛栽田比移栽田和直播田发病轻。不同播种期显著影响南方水稻黑条矮缩病的发病率。在化州稻区,播种早的发病重于播种迟的。晚稻秧田靠近早稻本田的田块,南方水稻黑条矮缩病发病重,秧田远离早稻本田的田块发病较轻。6月中旬-7月上旬降水日数、6月下旬-7月上旬相对湿度和8月上旬平均最高气温等气象因子与南方水稻黑条矮缩病发病率关系最密切。     

不同生育期水稻黑条矮缩病的症状特点、诊断及防治

本文介绍了水稻苗期、分蘖期、抽穗期和灌浆期期水稻黑条矮缩病的症状特点,提出了诊断中应该注意的问题,并介绍了水稻黑条矮缩病的病原生物学及主要的防治措施。     

水稻OsAGO家族成员特征及对RGDV和SRBSDV的响应

为初步探究OsAGO家族在水稻抗病毒通路中的功能,对水稻OsAGO蛋白的基因组结构、系统发育关系、氨基酸序列及水稻瘤矮病毒（rice gall dwarf virus,RGDV）和南方水稻黑条矮缩病毒（southern rice black streaked dwarf virus,SRBSDV）侵染后的转录组数据进行分析,同时采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）技术对这2种病毒侵染后OsAGO基因的相对表达量变化进行验证。结果表明,19个水稻OsAGO蛋白的外显子数量、内含子数量及编码区长度存在较大差异,且这19个OsAGO蛋白均匀分布在3个分支中;OsAGO蛋白PAZ结构域中与小RNA结合相关的YF（酪氨酸-苯丙氨酸）基序在OsAGO₂、OsAGO3和OsAGO5中变成了YY（酪氨酸-酪氨酸）,OsAGO蛋白PIWI结构域中与OsAGO蛋白切割活性相关的DDX（X代表H或D,即天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸/天冬氨酸）基序在OsAGO13中替换为LDH（亮氨酸-天冬氨酸-组氨酸）基序,而在OsAGO17中不包含YF基序且DDX基序替换为HDR（组氨酸-天冬氨酸-精氨酸）基序。RGDV侵染后OsAGO5和OsAGO12基因的转录组分析结果与qPCR结果一致,其中OsAGO5上调表达,OsAGO12下调表达;SRBSDV侵染后OsAGO1a、OsAGO1b、OsAGO1c、OsAGO1d和OsAGO4b基因的转录组分析结果与qPCR结果一致,均上调表达。表明大多数OsAGO均能响应RGDV和SRBSDV的侵染。