向日葵柄锈菌效应蛋白的预测及筛选

向日葵柄锈菌（Puccinia helianthi Schw.）引发向日葵锈病,对生产具有破坏性。为深入了解锈菌效应蛋白,研究病原与寄主的互作机理,在获得向日葵柄锈菌分泌蛋白组的基础上,利用生物信息学软件预测及分析向日葵柄锈菌效应蛋白,采用qRT-PCR检测其中7个候选效应蛋白基因在接种叶片中的相对表达量。结果表明：在供试的900个锈菌的分泌蛋白中预测到候选效应蛋白497个。基因特征分析显示,开放阅读框长度在200～399 bp之间的最多;信号肽长度集中在16～27个氨基酸残基（占92.96%）;信号肽氨基酸组成中亮氨酸出现频率最高,其次为丙氨酸、异亮氨酸;信号肽识别位点以SpⅠ型为主。本研究获得了7个向日葵柄锈菌的效应蛋白,qRT-PCR检测表明柄锈菌接种向日葵叶片后,与纯孢子相比,这7个效应蛋白编码基因均上调表达,说明其参与了锈菌侵染向日葵的过程。     

向日葵锈菌胞外金属蛋白酶的特性分析

为进一步了解锈菌侵染向日葵的致病机制,对向日葵锈菌(Puccinia helianthi)分泌的一种新型的金属蛋白酶(metalloproteinase,Mep)水解活性和生物学特性进行了表征。使用偶氮酪蛋白法测定蛋白酶的活性,在波长280 nm下测吸光度。结果表明,该蛋白酶对偶氮酪蛋白具有水解活性,纯酶最适温度和pH分别是50℃和7.0,在pH 5.0～9.0和温度50℃以下保持稳定。蛋白酶受到抑制剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、1,10-菲咯啉的显著抑制;Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺可以显著提高该蛋白酶的活性,表明该酶为金属蛋白酶。另外,利用qRT-PCR试验测定了基因Mep在锈菌侵染向日葵的过程中的表达情况,结果显示,在接菌48 h时,基因表达量达到高峰,后逐渐降低,表明该蛋白酶参与了锈菌对向日葵的早期侵染过程。     

向日葵锈菌侵染过程的超微结构研究

为了研究向日葵锈菌的致病机制,本文采用电子显微镜技术对向日葵锈菌的侵入和扩展过程进行了研究,结果表明,向日葵锈菌夏孢子萌发产生1个芽管,遇到合适结构的气孔后,在气孔上方形成附着胞从气孔侵入,胞间菌丝与叶肉细胞壁接触后分化出吸器母细胞,吸器母细胞进入叶肉细胞内部形成吸器。胞间菌丝在吸器母细胞处分化出次生菌丝,在叶肉细胞间扩展,病菌菌丝多在寄主细胞间隙或沿寄主细胞壁延伸。在病原菌侵染早期,寄主细胞的超微结构变化并不明显;侵染中、后期,被侵染叶肉细胞发生质壁分离,叶绿体膨胀变形,细胞器解体,细胞崩解。     

向日葵锈病抗性相关microRNA的挖掘及其靶基因预测

前期利用高通量测序技术及生物信息学分析方法,在向日葵上预测筛选到10个差异表达的新microRNA （miRNA）可能与锈病抗性相关。本试验利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术,对筛选到的10个miRNA做进一 步的定量验证。结果表明,相比于水处理的健康叶片(对照组A),接种锈菌300生理小种的叶片中（抗病组B）HanmiR21 、Han-miR25、Han-miR42表达量呈上调趋势,Han-miR11、Han-miR34、Han-miR43、Han-miR47、Han-miR67 表达量呈下调趋势;接种锈菌737生理小种的叶片中（感病组C）Han-miR25、Han-miR42的表达量呈上调趋势, Han-miR11、Han-miR21、Han-miR34、Han-miR43、Han-miR47、Han-miR67表达量呈下调趋势。qRT-PCR的检测 结果与前期高通量测序结果80%相一致。利用miRanda软件预测靶基因,10个miRNA共预测到117个靶基因,其 中86个靶基因获得其生物信息学功能注释。运用miRBase数据库,对10个新预测miRNA进行同源性分析发现,新 预测的10个miRNA与拟南芥、烟草、水稻等作物中参与病害逆境胁迫响应的miRNA有较高相似性（62%～100%）。 定量检测和验证miRNA作用的靶基因时发现,抗病组表达量上调的Han-miR21对应的靶基因有1个下调、表达量 下调的Han-miR43对应的靶基因有3个上调,符合miRNA与其靶基因互作的规律。     

细胞分裂素对向日葵生物效应的研究——Ⅰ.细胞分裂素对向日葵种子萌发及种苗生长影响

试验结果表明,适宜浓度的细胞分裂素能够促进向日葵种子的萌发,提高发芽势和发芽率,刺激种苗生长,干物质积累增加。细胞分裂素低浓度具有促进作用,高浓度具有抑制作用。     

柱花草内珠被、胚柄及胚乳细胞的程序性死亡

利用石蜡切片技术对柱花草胚胎发育过程中内珠被、胚柄及胚乳细胞进行显微观察。结果表明：上述胚珠和胚体的结构成分在胚胎发育进程中相继发育然后程序性地死亡。胚珠受精作用发生后，内珠被的内表皮细胞发育形成珠被绒毡层。原胚时期，珠被绒毡层外侧的内珠被细胞退化。球形胚时期，珠被绒毡层退化。鱼雷形胚时期，胚柄退化。扩大生长胚时期，胚乳细胞退化。内珠被、胚柄及胚乳细胞的发育和程序性死亡均与不同发育时期胚的营养物质供应和形态建成相关。     

向日葵下胚轴体细胞胚发生的基因型效应

为了探讨向日葵不同基因型之间体细胞胚发生能力,采用来源于PAC-2和RHA-266的重组自交系(R ILs)、以及来源于LR35×C149和C149×C40杂交的2个F1杂交种、16个F3家系及其亲本为材料,研究了向日葵下胚轴体细胞胚发生率和每块胚数的基因型效应。结果表明,各基因型之间的胚发生率和每块胚数的差异均达0.1%极显著水平,胚发生率的变幅为0~93.77%,而每块胚数变幅在0~10.63之间;两个群体的杂种F1的胚发生率均显著地高于亲本平均值,表现出一定的优势;重组自交系和杂交F1的两个亲本的胚发生率和每块胚数差异均达显著水平。     

小麦抗病相关基因TaTGA2.2在小麦-条锈菌互作中的表达分析及功能研究

为了进一步解析小麦与条锈菌(Puccinia striiformis f. sp.tritici,Pst)互作中的抗病分子机制,在小麦-条锈菌互作的cDNA文库中分离得到一个编码bZIP类转录因子的小麦抗病相关基因 TaTGA2.2。通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)以及病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)对 TaTGA2.2的表达模式及其在小麦与条锈菌互作中的功能进行了初步解析。结果表明,小麦 TaTGA2.2基因全长1 005 bp,编码334个氨基酸,具有bZIP保守结构域以及TGA转录因子类似结构域。进化树分析发现TaTGA2.2与一粒小麦中TGA蛋白近缘。拟南芥原生质体亚细胞定位发现TaTGA2.2分布在细胞核,酵母自激活实验表明TaTGA2.2蛋白N端具有转录激活活性。此外, TaTGA2.2受条锈菌诱导表达,且非亲和互作中的表达量较亲和互作明显增高。非生物胁迫处理中干旱、盐以及外源激素水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)也能诱导 TaTGA2.2上调表达。VIGS沉默 TaTGA2.2基因后,发现接种条锈菌CYR23及CYR31后小麦的表型均无明显变化。另外,PR基因的表达量也无显著差异,表明植物中可能存在与 TaTGA2.2功能冗余的TGA成员。     

外源亚精胺对向日葵幼苗盐碱胁迫的缓解效应

为提高向日葵幼苗的耐盐碱性,以向日葵品种SH361为材料,采用叶面喷施的方法,研究盐碱胁迫下不同浓度(0.5、1.0、1.5 mmol·L^-1)亚精胺对向日葵幼苗生长和生理特性的影响。结果表明,盐碱胁迫显著抑制了向日葵幼苗的生长,丙二醛比对照含量升高77.8%,相对电导率增加至对照的2.6倍,向日葵幼苗通过增加渗透调节物质和提高抗氧化酶活性以适应盐碱胁迫环境;叶面喷施外源亚精胺,则显著提高向日葵幼苗对盐碱胁迫的抗性,其中亚精胺浓度为1.0 mmol·L^-1时效果最明显,向日葵幼苗的生长指标及生物量增长显著,对渗透调节物质含量的提高以及对细胞脂膜损伤的降低,效果均达30%以上,SOD、POD和CAT活性也分别提升1.7倍、1.4倍和1.3倍。由此认为,适宜浓度的亚精胺可通过提高生理水平的抗逆性来提高向日葵幼苗的耐盐碱能力,从而有效缓解盐碱胁迫对幼苗生长的抑制作用。     

向日葵品种对锈病抗性的组织学和超微结构研究

为了进一步了解向日葵与向日葵锈病病菌的互作关系及品种的抗性机制,采用电子显微镜技术对向日葵品种对锈病抗性的组织学和超微结构进行研究.在电镜下观察发现,向日葵锈病菌侵染向日葵后,在感病品种和抗病品种上发育的组织学和超微结构特征有明显差异.病菌在感病品种细胞间隙分布有大量的胞间菌丝,寄主细胞发生质壁分离;叶绿体变形,叶绿体的片层结构排列零乱,直至叶绿体解体.在抗病品种上表现为菌丝生长受抑,没有观察到吸器的产生,寄主细胞的早期坏死与锈菌的发育受阻密切相关.品种的抗病性可能与饥饿阻止真菌生长有关.     

茶树磷转运蛋白基因CsPT4的克隆、亚细胞定位及表达分析

茶园中磷肥的利用效率取决于茶树体内与磷元素吸收、转运及生理利用等相关蛋白的协同调控,而磷转运蛋白(Phosphate transporter proteins,Phts)在此过程中起着关键的调控作用。本研究以茶树品种龙井长叶(Camellia sinensis cv.Longjing-changye)为试验材料,采用同源克隆的方法首次克隆获得茶树磷转运蛋白编码基因Cs Pht1:4(Cs PT4)的全长c DNA。该基因全长1 642 bp,开放阅读框(ORF)1 620 bp(Gen Bank登录号:KY132100),编码539个氨基酸。生物信息学分析显示,Cs PT4基因编码蛋白分子量为59.12 k D,理论等电点(p I)为8.51;具有典型的Pht1家族特性:"6-亲水-6"跨膜结构。亚细胞定位结果显示,该蛋白分布于质膜上,与Softberry软件预测结果一致。荧光定量PCR表明:Cs PT4在正常生长的茶树根、茎、嫩叶、老叶中均有表达,在老叶中的表达量较高,在根部表达量最低。低磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均先上升后下降;根部Cs PT4表达量48 h内各个时间点均高于叶部。缺磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均升高;根部和叶部分别在72 h和48 h达最大值。本研究为茶树响应低磷的分子机制提供了参考。     

槟榔Catalase基因的克隆及亚细胞定位

过氧化氢酶（Catalase）广泛存在于生物体内,主要功能是清除植物细胞内光呼吸、线粒体电子传递及脂肪β-氧化等过程中产生的H₂O₂,从而保护细胞免于过氧化氢酶的毒害。为了解槟榔过氧化氢酶基因的相关信息,利用植物总RNA提取试剂盒提取槟榔叶片总RNA,通过同源克隆和RACE技术获得槟榔全长cDNA,并对其进行生物信息学分析及亚细胞定位。结果表明：获得ArCAT1（MN692600）、ArCAT2（MN692601）、ArCAT3（MN692602）3个同源基因,其序列全长均为1476 bp,编码492个氨基酸。遗传进化分析显示,ArCATS与同为棕榈科的油棕（Elaeis guineensis）、海枣（Phoenix dactylifera）等植物的过氧化氢酶氨基酸序列具有较高的相似性,其中与油棕的亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明,ArCAT1蛋白定位于过氧化物酶体中,而ArCAT2和ArCAT3既定位于过氧化物酶体又定位于细胞核中。这为进一步研究Catalase基因在槟榔中的生物学功能奠定基础。     

龙眼DCL4的亚细胞定位分析及其对外源ABA和SA的响应

为了研究DlDCL家族中DlDCL4基因在龙眼中的功能,本研究通过氨基酸序列比对、系统发育进化树的构建、亚细胞定位验证、实时荧光定量PCR(qPCR)等方法,对其进行初步探究.结果表明:遗传进化分析显示,DCL4氨基酸序列在所选的物种间相似度高于50％,其中龙眼与甜橙(Citrus sinensis)的亲缘关系最近.在...     

液泡蛋白酶在植物细胞程序化死亡中的作用

通过分子手段鉴定控制植物细胞程序化死亡的关键执行因子非常困难。一种来自植物细胞液泡的特异性很强的蛋白酶,被称作VPE,它能裂解胱天蛋白酶特异底物,且在烟草花叶病毒激活的细胞死亡中必不可少。本文对植物中蛋白质水解如何充当PCD调节因子的开关,VPE如何激活过敏性细胞死亡程序,豆蛋白酶(VPE)的CLP活性及其在植物细胞死亡中的作用,植物PCD反应途径及其调节因子的复杂性等方面进行简要综述。     

淹水胁迫下小麦根通气组织形成的PCD特征及活性氧作用初探

为了解淹水条件下小麦根通气组织形成的细胞学特点和活性氧(Reactive oxygen species, ROS)在通气组织形成中的作用,以高度耐湿的华麦8号幼苗为材料进行淹水处理,在显微水平上系统地观察了通气组织的形成过程,在分子水平上检测了细胞核DNA的断裂情况,并对ROS的动态变化进行了荧光观察.结果表明:(1)通气组织最先起源于根皮层中部,然后逐渐扩展,到淹水8 d时基本形成,淹水60 d时更为发达;(2)淹水1.5～48 h根皮层出现大量细胞核DNA断裂,且细胞核DNA降解为180～200 bp的片段,证明小麦根通气组织的形成过程是根皮层细胞发生细胞程序化死亡(Programmed cell death, PCD)的过程,而且淹水1.5～48 h是根皮层细胞死亡高峰期;(3)ROS在细胞核DNA发生断裂前开始积累,在通气组织形成中呈现动态变化.上述结果表明, 淹水胁迫下小麦根通气组织形成是一个皮层细胞PCD的过程,并且ROS可能参与介导了PCD的进程.另外,淹水胁迫在前期抑制了次生根的产生,随后又促进了次生根的产生.     

橡胶树HbPIP1;1基因的克隆及蛋白的亚细胞定位与多聚化分析

水通道蛋白（aquaporin）是一类广泛存在生物体中高效转运水分子的膜内在蛋白,其在生物膜上以同源或异源四聚体的形式起作用。根据序列相似性及亚细胞定位,植物水通道蛋白可分为PIP （plasma membrane intrinsic protein）、TIP（tonoplast intrinsic protein）、NIP（NOD26-like intrinsic protein）、SIP（small basic intrinsic protein）和XIP（X intrinsic protein）等5大类,其中,PIP定位在细胞膜,是介导细胞间水分跨膜运输的主要通道。橡胶树最早起源于南美亚马逊河流域,是目前天然橡胶的主要商业来源。与其他植物相比,橡胶树除蒸腾耗水外,周期性的割胶活动也会造成水分的大量流失,因此,水分平衡对于橡胶树尤为重要。为揭示橡胶树水分平衡的分子机制,采用RT-PCR技术对1个PIP类水通道蛋白基因HbPIP1;1进行克隆,并在此基础上对其编码蛋白的亚细胞定位和多聚化特征进行分析。结果显示：该基因的编码区长864 bp,预测编码287 aa,其理论分子量为30.80 kDa、等电点8.59、不稳定系数49.27、脂肪族指数22.34、总平均疏水指数为0.639,属于不稳定的疏水型碱性蛋白;蛋白含有水通道蛋白家族特有的MIP（major intrinsic protein）结构域及6个典型的跨膜螺旋,每个螺旋的残基数介于20~23之间。研究构建了基因的亚细胞定位分析载体,并采用农杆菌介导法对烟草叶片进行了瞬时转化。荧光共聚焦显微镜观察显示,HbPIP1;1蛋白定位在细胞膜,与用生物信息学手段预测的结果一致。在烟草叶片中的双分子荧光互补实验显示,HbPIP1;1蛋白自身不能互作,这进一步得到了点对点的酵母双杂交实验的证实。以上结果表明HbPIP1;1蛋白可能通过异源互作的方式参与橡胶树水分的平衡。     

Dynamics of dissolved and particulate polyunsaturated aldehydes in mesocosms inoculated with different densities of the diatom Skeletonema marinoi

A survey of the production of polyunsaturated aldehydes (PUA) of manipulated plankton communities is presented here. PUA are phytoplankton-derived metabolites that are proposed to play an important role in chemically mediated plankton interactions. Blooms of different intensities of the diatom Skeletonema marinoi were generated in eight mesocosms filled with water from the surrounding fjord by adding different amounts of a starting culture and nutrients. This set-up allowed us to follow PUA production of the plankton community over the entire induced bloom development, and to compare it with the natural levels of PUA. We found that S. marinoi is a major source for the particulate PUA 2,4-heptadienal and 2,4-octadienal (defined as PUA released upon wounding of the diatom cells) during the entire bloom development. Just before, and during, the decline of the induced diatom blooms, these PUA were also detected in up to 1 nM concentrations dissolved in the water. In addition, we detected high levels of the PUA 2,4-decadienal that was not produced by the diatom S. marinoi. Particulate decadienal correlated well with the cell counts of the prymnesiophyte Phaeocystis sp. that also developed in the fertilized mesocosms. Particulate decadienal levels were often even higher than those of diatom-derived PUA, indicating that PUA sources other than diatoms should be considered when it comes to the evaluation of the impact of these metabolites.     

水稻雌雄不育突变体Osfma2的细胞学观察及基因图位克隆

【目的】通过构建分离群体定位并克隆水稻雌雄不育基因OsFMA2,并对其在水稻育性调控中的功能进行探究。【方法】通过EMS诱变水稻宁粳4号得到稳定的不育突变体,对突变体进行表型及细胞学观察,利用精细定位和Mut-map相结合的方法克隆了水稻雌雄不育基因OsFMA2,通过实时荧光定量PCR检测其在各组织表达水平差异,利用水稻原生质体表达系统进行OsFMA2蛋白的亚细胞定位。【结果】细胞学观察发现突变体为雌雄不育。利用极端个体将其精细定位于水稻第6染色体长臂448 kb的区间内。结合全基因组重测序结果,最终确定OsFMA2为目标基因。该基因编码一个复制蛋白,在单子叶植物中高度保守。OsFMA2具有组织特异性,在幼穗中高表达。亚细胞定位结果显示OsFMA2蛋白定位于细胞核中。【结论】OsFMA2在幼穗中高表达,可能参与了水稻雄配子第一次减数分裂前期同源重组过程,同时,OsFMA2的表达对雌配子发育也产生了不利影响。