脂多糖对牛乳腺上皮细胞自噬和凋亡的影响

为探究脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对牛乳腺上皮细胞(MAC-T)自噬和凋亡的影响,以MAC-T细胞为试验对象,用CCK-8和乳酸脱氢酶(LDH)法检测不同浓度LPS(100、150、200、250μg/mL),检测细胞的存活率和损伤,从上述分组中挑选浓度为0(对照)、50、100、200μg/mL的LPS建立试验组,Hoechst33342检测细胞核形态,qPCR法检测MAC-T细胞中自噬和凋亡基因(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)mRNA的表达量,Western blot检测MAC-T细胞中自噬和凋亡(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)相关蛋白表达。结果显示,MAC-T细胞的活力会随着LPS的浓度和时间的推移下降,细胞上清中的LDH随着LPS浓度上升而增加,Hoechst33342染色后可以发现细胞核形态出现异型性,染色质碎裂、固缩。qPCR和Western blot检测结果显示LPS在50～100μg/mL浓度下可引起MAC-T细...     

凋亡和ERK信号在镉诱导神经细胞自噬中的作用

为了探讨凋亡和ERK信号与镉诱导大鼠大脑皮质神经细胞自噬的关系,本研究用20μmol/L镉作用大鼠大脑皮质神经细胞4h,免疫荧光观察自噬小体,吖啶橙染色观察酸性自噬泡的形成;20μmol/L镉单独或联合氯喹作用4h、联合雷帕霉素或caspase抑制剂Z-VAD-fmk作用24h,DAPI荧光染色观察细胞核的变化;20μmol/L镉联合ERK抑制剂U0126作用4h,免疫印迹检测ERK、LC3的表达变化。结果表明:镉处理4h,大脑皮质神经细胞发生明显的聚点现象,吖啶橙染色可见酸性自噬泡的形成;与正常组比较,镉处理24h后神经细胞出现染色质固缩、核碎裂;镉联合氯喹作用4h,损伤的神经细胞增多,出现新月状、浓缩的胞核,甚至出现核碎裂;而镉联合雷帕霉素或ZVAD-fmk组,细胞的损伤明显减轻。U0126能明显抑制原代神经细胞ERK1/2的磷酸化水平,同时还能显著抑制LC3-II的表达(P0.05)。说明镉诱导的自噬可以延迟凋亡的发生;ERK是自噬的上游信号分子,它的激活有利于诱导自噬。     

GSTO1基因沉默对氟致成骨细胞自噬与凋亡的影响

为探讨氟致成骨细胞自噬和凋亡中GSTO1的作用机制,利用RNA干扰(RNAi)技术,抑制GSTO1基因在小鼠成骨细胞中表达,检测染氟小鼠成骨细胞中自噬和凋亡相关基因表达。针对小鼠成骨细胞GSTO1mRNA序列设计、合成3对21核苷酸序列siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3);从3对序列中筛选最佳有效片段,然后检测不同质量浓度氟化钠(10~4、10~3、10~2、10、1mg·L^-1)下GSTO1的mRNA转录,确定最佳氟浓度。试验分为空白对照组(control)、阴性对照组(NC-siRNA)、氟化钠组(1mg·L^-1)、沉默目的基因组(siRNA-GSTO1)和氟化钠加沉默目的基因组(NaF/siRNA-GSTO1),用RT-PCR技术检测成骨细胞自噬相关基因LC3、p62、Beclin1、Atg3、Atg5和凋亡相关基因BCL2、Caspase-3的转录,同时应用Western blot技术检测LC3、p62、Beclin1、Atg3和Atg5蛋白表达。结果显示:用HE、吉姆萨、碱性磷酸酶、茜素红四种染色法鉴定试验所用细胞为成骨细胞。确定试验模型中50nmol·L^-1为siRNA的最佳转染浓度,siRNA2为最佳沉默转染片段,NaF的最佳浓度为1mg·L^-1。成骨细胞染氟与GSTO1基因抑制均可使LC3、Beclin1、Atg5和BCL2基因转录显著升高,p62和Caspase-3基因转录显著下降;但与NaF组相比较,NaF/siRNA-GSTO1组LC3、Beclin1、和Atg5基因mRNA转录水平显著降低(P<0.05),而p62和Caspase-3基因转录显著升高(P<0.05)。Western blot检测成骨细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin1、Atg5和p62的表达与基因转录趋势完全一致。结果表明,低剂量氟与沉默GSTO1表达均可致成骨细胞自噬增强的同时凋亡减弱,GSTO1对低剂量氟致成骨细胞自噬增强与抑制凋亡有一定的协同效应。     

氧化应激对家禽卵泡颗粒细胞凋亡和自噬的影响及机制研究进展

氧化应激生成的高水平ROS能够影响卵泡颗粒细胞相关转录因子的表达和转录,诱导凋亡和自噬下游相关基因的表达,引起颗粒细胞凋亡和自噬,最终导致卵泡闭锁,影响动物的卵巢功能与生产性能。本文通过对家禽卵泡发育、氧化应激对家禽卵泡的影响,以及氧化应激影响细胞凋亡和自噬导致家禽卵泡闭锁的机制等方面进行综述,以期为缓解家禽氧化应激、预防相关疾病、提高产蛋量提供一定理论依据。     

BmATG5蛋白作为分子开关调控家蚕细胞自噬和凋亡关系的研究进展

细胞自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)是昆虫蜕皮与变态发育过程中细胞死亡最主要的2种方式。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目的模式昆虫之一,有关细胞自噬和凋亡的研究也比较深入,包括细胞自噬和凋亡的形态特征、诱导信号和通路、对蚕体发育的影响、自噬相关蛋白的鉴定和功能等。前期研究揭示家蚕自噬相关蛋白Bm ATG5和Bm ATG6具有自噬与凋亡的分子开关功能,但它们调控细胞凋亡的具体机制至今不详。本文在简要综述昆虫及家蚕细胞自噬和凋亡研究的基础上,重点介绍了Bm ATG5调控细胞凋亡分子机制研究的最新进展,为深入揭示Bm ATG5的分子调控功能,以及其应用于鳞翅目害虫防治和家蚕变态发育调控的研究提供参考依据。     

自噬调节剂对感染日本脑炎病毒小鼠脑部细胞凋亡的影响

旨在研究自噬调控药物对感染日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)小鼠脑部细胞凋亡的影响,本试验建立自噬调控药物处理的感染日本脑炎病毒小鼠的动物模型,其中,雷帕霉素为自噬诱导剂,渥漫青霉素及氯喹为自噬抑制剂.实验动物分成8组:DMEM对照组(Control);JEV感染组(JEV)...     

卡介苗诱导巨噬细胞系RAW264.7发生自噬与凋亡的细胞感染模型的建立

结核病(tuberculosis, TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,Mtb)所致的人畜共患的慢性、消耗性传染病。先天免疫细胞与Mtb的相互作用通过自噬、细胞凋亡及炎症反应等途径影响结核病的发生与发展。旨在探究减毒牛分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7后,能否发生自噬与细胞凋亡。试验以BCG不同感染复数与感染时间感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,通过Western blot法检测自噬及凋亡相关蛋白LC3B-II、Beclin1、Bcl-2和Caspase3的表达水平,MTT法检测细胞存活率,透射电镜观察感染BCG的巨噬细胞形态学变化,探究BCG感染RAW264.7是否会发生自噬和凋亡,进而确定BCG感染巨噬细胞的最佳浓度与时间。通过对巨噬细胞的分子水平和形态学检测发现,BCG以感染复数为10,感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7时间为12 h时,感染组自噬有关蛋白Beclin1、LC3B-II,促凋亡蛋白Caspase3的相对表达水平极显著高于对照组(P<0....     

牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞的增殖和自噬影响的初步探究

为探究牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞系(RAW264.7细胞)增殖和自噬的影响,本研究将牛坏死杆菌A25株以MOI 10感染RAW264.7细胞作为实验组,以未感染的RAW264.7细胞作为对照组。分别于感染后1 h、2 h、4 h收集细胞,采用Ed U和MDC染色法观察细胞荧光,并计算各组细胞增殖率及细胞自噬小体的数量。Ed U染色法观察可见,各实验组随着感染时间的延长,绿色荧光的量逐渐减少,对照细胞绿色荧光的量基本无变化,且与对照组相比,随着感染时间的延长,感染组细胞增殖率均极显著降低(P<0.05);MDC染色法观察结果可见,与对照组相比,随着感染时间的延长,感染组细胞中的绿色荧光逐渐增强,且随着感染时间的延长,细胞中自噬小体的数量与对照组相比均极显著增多(P<0.01)。上述结果表明,牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后抑制细胞的增殖,并且诱导该细胞发生自噬。分别采用荧光定量PCR (RT-qPCR)和western blot检测上述各组细胞中自噬基因Beclin-1和P62 mRNA的相对转录水平及自噬蛋白LC3和P62的相对表达水平。RT-q PCR结果显示,与对照组...     

鸡TGFβ1对MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响

旨在探讨鸡TGFβ1对MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。作者将构建的鸡TGFβ1过表达载体、干扰表达载体以及相应阴性对照转染MDCC-MSB1细胞,然后检测转染后各组细胞鸡TGFβ1的表达水平、细胞增殖能力、细胞周期与凋亡,细胞的迁移与侵袭能力。结果显示,与相应阴性对照相比,转染TGFβ1过表达质粒可显著上调MDCC-MSB1细胞的TGFβ1表达水平,显著抑制MDCC-MSB1细胞的增殖,且使G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时增加细胞凋亡率,降低细胞的迁移与侵袭能力;转染TGFβ1干扰表达质粒可显著下调MDCC-MSB1细胞的TGFβ1表达水平,显著促进MDCC-MSB1细胞的增殖,G1期细胞减少、S和G2期细胞增加,同时降低细胞凋亡率,增加细胞的迁移与侵袭能力。结果表明,鸡TGFβ1可抑制MDCC-MSB1细胞增殖、迁移与侵袭,促进其凋亡。     

FOXO3基因过表达对鹅卵泡颗粒细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达水平的影响

本研究首先克隆鹅FOXO3基因编码区(CDS)序列,构建FOXO3基因的真核表达载体,然后将其转染至鹅卵泡颗粒细胞中,利用荧光定量PCR方法检测FOXO3基因对细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达水平的影响。结果显示,本研究成功克隆了鹅FOXO3基因CDS序列,并由此构建了真核表达载体pcDNA3.1-FOXO3。鹅卵泡颗粒细胞FOXO3基因过表达实验发现,过表达组凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Fasl的mRNA表达水平较对照组均升高(P<0.05),而自噬相关基因LC3和Beclin1的mRNA表达水平较对照组均降低(P<0.05)。本研究结果表明,FOXO3基因可能影响鹅卵泡颗粒细胞中凋亡及自噬相关基因的表达,进而调控颗粒细胞的凋亡和自噬。     

脂多糖刺激后不同时间点断奶仔猪肠道中凋亡和自噬信号通路的动态变化

本试验旨在研究脂多糖（LPS）刺激后不同时间点断奶仔猪空肠中凋亡和自噬相关基因表达的变化。选取42头21日龄、体重（7.09±0.90） kg的杜×长×大断奶仔猪,按照注射LPS后时间点的不同随机分成7个处理,每个处理6个重复,每个重复1头猪。预试14 d后,仔猪腹膜注射100μg/kg BW的LPS,分别在注射前（0 h）和注射后1、2、4、8、12、24 h屠宰仔猪,取空肠样品,检测凋亡和自噬相关基因的表达。结果表明：与注射前相比,LPS刺激后,Fas配体（Fasl）的mRNA相对表达量在12和24 h均显著升高（P <0.05）; B淋巴细胞瘤XL蛋白（Bcl-xl）的mRNA相对表达量在2 h显著下降（P <0.05）;半胱天冬蛋白酶3(Caspase 3)的mRNA相对表达量在2 h显著升高（P<0.05）;Bcl-2相关X蛋白（Bax）的mRNA相对表达量在12 h极显著升高（P<0.01）;哺乳动物雷帕毒素靶蛋白（mTOR）的mRNA相对表达量在1和2 h显著下降（P<0.05）;关键调控因子自噬微管相关蛋白1轻链3(LC3)和Unc-51激...     

硒对金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬及胞内细菌增殖的影响

为探讨硒对金黄色葡萄球菌(S.aureus)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)自噬和细菌增殖的影响,本试验通过蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1和p62蛋白的表达,免疫荧光检测GFP-LC3与溶酶体的共定位,细菌平板计数检测胞内S.aureus增殖情况。结果发现S.aureus感染后,细胞内自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1和p62蛋白显著升高,GFP-LC3绿色聚点与溶酶体无明显共定位;硒添加后,能够显著或极显著降低S.aureus诱导的LC3和p62蛋白的表达,同时促进GFP-LC3与溶酶体的共定位,降低S.aureus的胞内增殖。综上所述,S.aureus感染诱导BMECs发生自噬,自噬体和溶酶体无法融合,自噬流阻塞。而硒促进自噬体和溶酶体融合,并缓解了自噬流的阻塞,降低S.aureus胞内增殖,这为临床金黄色葡萄球菌性乳腺炎的预防和治疗提供理论基础。     

抑制PERK对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬的影响

旨在研究PERK在脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬中的作用。首先,试验设对照组(CON)和LPS组(LPS,4μg·mL^-1),研究LPS对奶牛乳腺上皮细胞内质网应激和自噬的影响;随后用不同浓度的PERK抑制剂GSK2606414(GSK)预处理细胞,通过测定PERK、ATF4、eIF-2α和CHOP的mRNA表达,筛选出GSK的最佳抑制浓度;最后将奶牛乳腺上皮细胞分为对照组(CON)、LPS组(LPS)、GSK+LPS组(GLPS)和GSK组4组,研究抑制PERK对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬的影响。采用RT-qPCR和Western blot分析内质网应激、自噬相关基因和蛋白的表达,通过免疫荧光检测GRP78和p62的荧光强度。结果表明：1)与对照组相比,LPS组的PERK、IRE1α、ATF6、GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高。LPS还可以显著升高LC3、ATG5、ATG14和Beclin1的mRNA和蛋白表达(P<0.01),并且显著降低p62的mRNA和蛋白表达(P...     

自噬对奶牛乳腺发育和功能影响的研究进展

自噬是细胞降解自身受损细胞器和长寿命蛋白的过程,有助于在饥饿、应激等情况下保护细胞存活。奶牛乳腺组织在青春期和妊娠期经历生长发育,在泌乳后期和干奶期进行退化再生,自噬在这2个过程中均发挥重要作用,既可以保护乳腺上皮细胞存活,又可以促使细胞发生程序性死亡。自噬也与机体中许多生理、病理过程相互作用,并受体内外多种因素的影响。本文就自噬的过程、自噬在奶牛乳腺组织生长发育和退化再生过程中发挥的作用及其影响因素进行综述,以期为通过调控自噬改善奶牛生产性能提供理论依据。     

高铜日粮对肉鸭肾氧化应激和自噬水平的影响

旨在探讨高铜(Cu)日粮对肉鸭肾氧化应激与自噬水平的影响。试验挑选144只1日龄北京鸭,随机分为4组：对照组、高铜Ⅰ组、高铜Ⅱ组和高铜Ⅲ组,分别饲喂铜含量为10、100、200、400 mg/kg的基础日粮。在试验的第15、30和45天采集肉鸭肾组织,检测氧化应激水平,观察超微病理学变化,分析自噬相关基因mRNA与蛋白(Beclin1、Atg5、Atg14、LC3A、LC3B、P62)的相对表达量。结果显示：与对照组相比,高铜Ⅲ组在45 d时肉鸭肾组织的T-sod、CAT活力下降,MDA和H₂O₂含量显著上升。高铜Ⅲ组肉鸭的自噬体数量较其他组增加。所有高铜处理组在30和45 d的Beclin1、Atg14、LC3A和LC3B mRNA表达水平显著升高,且45 d时高铜Ⅲ组的Beclin1和LC3B-II/LC3B-I的蛋白水平显著升高。高铜Ⅱ、Ⅲ组的LC3B-II荧光强度较对照组也显著增加。上述结果表明高铜诱导肉鸭肾氧化应激和自噬水平升高。     

金黄色葡萄球菌对巨噬细胞自噬相关蛋白表达的影响

巨噬细胞是机体重要的免疫防御细胞,本试验探讨金黄色葡萄球菌感染对巨噬细胞自噬相关蛋白表达的影响,为进一步研究自噬在金黄色葡萄球菌侵袭过程中的作用提供理论依据。采用金黄色葡萄球菌侵袭RAW264.7细胞,运用Western blot分别于侵袭0,15,30,45,60,90,120 min检测细胞内自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3、p62的表达水平,激光共聚焦技术检测细胞内LC3聚点,并用透射电镜观察细胞超微结构。结果显示,与侵袭0 min相比,Beclin1、Atg5、LC3、p62表达水平在各时间点均升高(P0.01),且呈一定的时间-效应关系。侵袭45 min时,细胞内LC3蛋白聚点增多,且单个细胞的荧光强度增强。透射电镜观察显示金黄色葡萄球菌侵入细胞内,并形成明显的吞噬泡。故金黄色葡萄球菌侵袭巨噬细胞,促进了细胞自噬的发生和发展,自噬参与了金黄色葡萄球菌的侵袭过程。     

镉对体外培养大鼠肝细胞自噬的影响

选用体外培养原代大鼠肝细胞为模型,醋酸镉处理之后,用Westernblot和免疫荧光法检测了自噬标记分子LC3的表达水平,在此基础上,利用自噬激活剂（雷帕霉素）诱导自噬水平的升高,用MTT法分析了镉对细胞存活率的影响。结果显示,原代大鼠肝细胞在体外培养过程中自噬水平具有缓慢上升的趋势,而镉处理延缓了这种趋势,降低了自噬的水平和细胞存活率;利用激活剂增强自噬后不能减弱镉的损伤,表明镉有可能通过抑制自噬的保护作用,造成对肝细胞的损伤。     

TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、FSH和TGFβ1对猪颗粒细胞增殖凋亡的影响

为研究TGF-β通路对猪颗粒细胞增殖、凋亡的影响,本研究对TGF-β通路基因进行调控处理,设计并筛选可高效干扰TGFβRⅠ及TGFβRⅡ表达的载体,转染不同干扰载体及添加10 ng/m L TGFβ1和25 ng/m L FSH,采用Westernblot、MTT和流式细胞法检测不同处理对颗粒细胞TGFβ RI和TGFβ RII蛋白表达量和细胞增殖凋亡的影响。结果表明：成功筛选出干扰效率最高的p OSP1-TGFβRⅠ-sh5和p OSP1-TGFβRⅡ-sh3载体,对TGFβRⅠ和TGFβRⅡ的抑制率分别为78.00%和84.10%;转染后TGFβRⅠ干扰组的TGFβRⅠ蛋白表达量显著低于其阴性对照组;TGFβRⅡ干扰组、TGFβ1组和FSH组的TGFβRⅡ蛋白表达量显著低于其阴性对照组;TGFβ RI干扰组、TGFβ RII干扰组的增殖抑制率极显著高于PLL3.7空载体组,TGFβ 1组细胞增殖抑制率极显著高于空白对照组且FSH组的增殖抑制率显著高于空白对照组;TGFβRⅠ干扰组和TGFβRⅡ干扰组细胞凋亡率极显著高于PLL3.7空载体组;TGFβ1组和FSH组细胞凋亡率极显著高于...     

抑制BET蛋白对水牛支持细胞自噬的影响

旨在探究抑制水牛BET(bromodomain and extra terminal, BET)蛋白对支持细胞自噬调控的影响。以水牛支持细胞(sertoli cells, SCs)为研究对象,首先从睾丸中分离纯化得到高纯度的SCs,通过免疫荧光法及RT-PCR法检测出水牛SCs的标记基因均正常表达。结果显示,BET蛋白被抑制后,水牛SCs形态和数量发生显著变化,细胞的体积变大,数量减少,折光性减弱,免疫荧光分析和MDC分析也证实其生物学功能受到影响。超微结构分析发现,水牛SCs中产生大量自噬体、自噬溶酶体以及自噬空泡,且自噬相关标记基因的表达量显著提升。说明抑制BET蛋白可引起水牛SCs活性和自噬活性降低,并导致自噬体增多。结果表明,本试验为BET蛋白调控雄性生殖机制的研究提供了依据。     

TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响

应用特异性方法检测转化生长因子(TGF-β1)对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的作用,用不同浓度的TGF-β1作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,在不同时间收集培养细胞及其培养液,应用MTT法检测细胞增殖、应用分光度法检测caspase-3活性、测定DNA片段化率法检测细胞凋亡。结果表明,1、5、10ng/mL TGF-β1试验组与对照组比较细胞增殖差异显著(P<0.05),随TGF-β1浓度增大抑制细胞增殖作用增强。细胞凋亡检测显示,1、5、10ng/mL TGF-β1试验组与对照组比较细胞凋亡差异均显著(P<0.05),随TGF-β1浓度增大促进细胞凋亡作用增强。TGF-β1可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖,促进奶牛乳腺上皮细胞凋亡。