木薯MeSAP13基因的克隆及其抗细菌性枯萎病功能鉴定

胁迫相关蛋白（stress-associated proteins, SAPs）在植物对胁迫应答和胁迫调控中起重要作用。木薯是我国重要的粮食作物和经济作物,细菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）已严重危害我国木薯产业的健康发展。为了探讨木薯MeSAP基因在抗细菌性枯萎病中的作用,本研究克隆了我国主栽木薯品种‘华南8号’（SC8）的MeSAP13基因,分析该基因在细菌性枯萎病病原菌侵染时的表达模式及其编码蛋白的基本特性。利用基于木薯花叶病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）技术抑制了MeSAP13基因在木薯SC8叶片中的表达,通过接种细菌性枯萎病病原菌XpmHN11对MeSAP13的抗病功能进行抗性鉴定。结果发现：在病原菌XpmHN11侵染叶片3 d后MeSAP13基因表达量显著上调,说明木薯MeSAP13基因能够响应病原菌的侵染;在VIGS载体转化木薯叶片40 d后发现,与转化pCsCMV-A载体的对照叶片相比,MeSAP13在转化pCsCMV-MeSAP13叶片中的表达量显著下调了40%~60%,表明通过VIGS技术成功抑制了MeSAP13在木薯叶片中的表达。将病原菌XpmHN11接种至MeSAP13基因沉默叶片和对照植株叶片,发现MeSAP13基因沉默植株接种叶片的水渍状病斑面积显著大于对照植株接种叶片。分析侵染后0、3、6 d病原菌XpmHN11的繁殖情况发现,在侵染后3 d和6 d的MeSAP13基因沉默植株接种叶片中,其病原菌数量显著高于对照植株接种叶片。以上研究结果表明,抑制MeSAP13基因的表达,降低了木薯对细菌性枯萎病的抗性。     

木薯MeNAC29、MeNAC30基因的克隆及表达分析

NAC(NAM/ATAF/CUC)基因家族是广泛分布于陆生植物的一类转录因子,在植物生长发育和胁迫应答的调控中发挥重要作用。本文对该基因家族在木薯抗细菌性萎蔫病方面的作用机制进行了初步研究。采用RT-PCR技术从木薯cDNA中克隆了MeNAC29和MeNAC30基因,并采用qRT-PCR技术对抗、感种质受木薯萎蔫病菌(Xanthomonas axonopodispv.manihotis,Xam)侵染后2个基因的表达变化进行了定量分析。结果表明,2个基因均含有3个外显子和2个内含子,且均有保守的NAM结构域。MeNAC29基因的开放阅读框全长888 nt,编码295 aa。MeNAC30基因的开放阅读框全长870 nt,编码289 aa。接种木薯萎蔫病菌后,抗病种质中MeNAC29和MeNAC30基因的表达量显著高于感病品种,表明这2个基因参与了木薯对细菌性萎蔫病菌的抗性反应。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

木薯MYB转录因子MeMYB2特性及功能分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,其部分成员在植物非生物胁迫响应过程中发挥着重要的调控作用。通过转录组数据分析,筛选到了多个木薯干旱胁迫相关的MYB类基因,本研究针对其中的1个MYB转录因子MeMYB2展开研究。MeMYB2蛋白N末端与AtMYB60蛋白的N末端氨基酸序列具有95%以上的相似度,但其C末端氨基酸序列与AtMYB60只有30%左右的相似度。编码该蛋白的基因在木薯成熟叶片中优势表达,并且其表达受干旱胁迫负调控。MeMYB2蛋白主要定位于细胞核中,且在酵母中具有明显的转录自激活活性,其转录激活结构域在蛋白C末端247~267位点之间的20个氨基酸残基内。利用酵母双杂交系统从木薯cDNA文库中筛选到了8个与MeMYB2互作的蛋白,其中的2个蛋白与气孔运动和光合作用有关。MeMYB2-RNAi转基因木薯成熟叶片的失水率显著低于野生型木薯成熟叶片,说明MeMYB2转录因子负调控木薯叶片失水率,推测其可能具有调控气孔运动的功能。     

龙眼DlWRKY52基因克隆及表达分析

WRKY转录因子在植物的生长发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。前期研究发现,部分WRKY基因（比如DlWRKY52）参与了龙眼的成花诱导和逆境胁迫响应过程。为进一步研究龙眼WRKY基因的功能,以‘四季蜜’龙眼叶片cDNA为模板克隆得到DlWRKY52基因,并对其序列特征、组织表达模式、花果发育过程表达模式及亚细胞定位进行研究。结果表明：DlWRKY52基因的开放阅读框（open reading frame, ORF）全长为918 bp,编码306个氨基酸,具有典型的WRKY结构域和锌指结构,属于Ⅱc型WRKY蛋白。qRT-PCR结果表明,DlWRKY52基因在叶片、茎和果实器官中高表达;在花后80 d的果肉中显著上调表达;特异在‘四季蜜’成花诱导中下调表达。拟南芥原生质体瞬时表达结果显示,荧光信号主要集中在细胞核。上述结果表明,作为典型的转录因子,DlWRKY52编码的蛋白定位于细胞核。DlWRKY52可能参与了龙眼成花诱导及果实早期发育调控。     

木薯MeHDS2基因的克隆与分析

采用RT-PCR技术,从木薯SC124 cDNA中克隆得到一个具有完整阅读框的基因,命名为MeHDS2,该基因全长2 529 bp,编码842个氨基酸。蛋白质保守结构域分析结果表明,MeHDS2蛋白含有保守的1个HD结构域、1个b-zip结构域、1个START结构域和1个MEKHLA结构域;蛋白质空间结构预测显示其具有3个典型的α螺旋结构;亚细胞定位结果表明,MeHDS2蛋白在植物细胞核中特异表达,因此,推测其为HD-ZIP转录因子家族中的一员。基因表达分析结果表明,MeHDS2基因在木薯根、茎、叶中都有表达,但表达丰度不同。木薯干旱处理14 d后,自形态学顶端往下数第三、四片叶片的MeHDS2表达量显著高于根、茎及其他位置叶片组织。本研究为木薯抗旱分子育种提供了理论基础。     

甘蔗近缘野生种蔗茅EfGRAS基因克隆及表达分析

为深入挖掘甘蔗品种的抗旱性能,本研究挑选甘蔗品种中参与调控抗旱机制的主要转录因子GRAS的基因进行表达分析。从转录组数据库中调取GRAS转录因子基因序列信息,采用RACE-PCR和qRT-PCR技术从‘蔗茅99-2’中克隆得到1个GRAS基因,将其命名为EfGRAS（GenBank登录号MT499789）,并对其进行生物信息学分析与干旱胁迫表达分析。结果表明,EfGRAS基因编码547个氨基酸,CDS全长1644 bp,该蛋白的分子式为C₂₆₄₅H₄₁₄₉N₇₄₇O₈₁₆S₂₁,相对分子质量为60.14 kDa,不稳定系数为54.85,脂肪系数为84.37,GRAVY值为?0.293,是一类不稳定蛋白和亲水蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内,EfGRAS蛋白主要的二级结构是α-螺旋和无规则卷曲,与高粱亲缘关系最近;qRT-PCR分析显示,受到干旱胁迫后,‘蔗茅99-2’中基因表达量相比于对照组上调约57.6倍,‘滇蔗01-58’中基因表达量相比于对照上调约27.4倍,‘崖城89-9’中基因表达量相比于对照组上调倍数较低。本研究结果为进一步研究EfGRAS基因在甘蔗中的功能提供理论基础。     

巴西橡胶树HbRPW8基因克隆与表达分析

RPW8（resistance to powdery mildew locus 8）是对植物多种病害,尤其白粉病具有抗性的广谱抗病基因位点,通过对橡胶树RPW8基因进行克隆及表达分析,为橡胶树抗白粉病机制解析和分子育种等方面打下基础。以橡胶树‘热研73397’为材料,采用RT-PCR克隆HbRPW8基因编码区（CDS）序列;对其进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR方法,测定7种激素和白粉菌侵染不同时间、不同病害等级处理后RPW8基因表达量。该基因cDNA全长570 bp,编码189个氨基酸,该蛋白的分子量为21.73 kDa,等电点为9.23,脂肪系数为86.30,总平均亲水性指数为-0.404,为亲水性蛋白,共有8个磷酸化位点,无跨膜域和信号肽,定位于细胞核,具有RPW8的保守结构域,α-螺旋和无规则卷曲是HbRPW8蛋白二级结构的主要元件,分别占氨基酸序列的70.90%和22.22%。亲缘关系显示,HbRPW8基因与木薯RPW8基因相似性最高。过氧化氢（H₂O₂）、水杨酸（SA）、乙烯利（ETH）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）能迅速诱导HbRPW8转录本的表达,并在处理后0.5 h达到最高水平,分别约为对照的14倍、6倍、75倍、2.5倍和4倍;茉莉酸甲酯（MeJA）处理后6 h达到最高水平,是对照的10倍左右;生长素处理后HbRPW8转录本显著下调;随着白粉菌侵染时间和病害等级的增加,HbRPW8的表达量均呈现先上升后下降的趋势。研究结果初步表明,HbRPW8可能参与橡胶树的抗病反应机制,为橡胶树抗病育种的研究提供参考。     

木薯一个假定的NBS类抗病基因的获得及其功能分析

根据已克隆植物NBS类抗病基因的保守结构域设计一对简并引物,以抗细菌性枯萎病木薯种质E1340基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得大小约0.5 kb的产物。该产物克隆、测序后比对木薯基因组数据库,分别获取其上下游各1.7 kb和2.0 kb的序列,进行基因预测。预测结果表明,扩增到的序列位于一个预测基因内,该基因命名为SNB1。序列分析表明,该基因编码986 aa,具有NBS类抗病基因的结构特征,是一个假定的抗病基因,可能在木薯抗细菌性枯萎病过程中发挥重要作用。     

甘薯IbGATA16基因的克隆与表达分析

GATA类转录因子在调控植物响应非生物胁迫中发挥重要作用。本研究从甘薯中克隆出1个IbGATA16基因，对其进行生物信息学分析，并对IbGATA16基因在甘薯干旱和盐胁迫处理中的表达模式进行分析。结果表明：甘薯IbGATA16基因CDS序列全长420bp，编码139个氨基酸，蛋白分子量为15.39kDa，等电点为9.97;IbGATA16基因组全长为582 bp，包含3个外显子和2个内含子；IbGATA16为不稳定的亲水性脂溶蛋白，亚细胞定位预测显示该蛋白定位于细胞核，具有C-X2-C-X17-C-X2-C结构域，属于典型的GATA类转录因子。IbGATA16基因上游1382bp的启动子序列存在多种顺式作用元件，如MYB、ABRE、GARE-motif等。多重序列比对和系统进化树分析结果显示，IbGATA16蛋白与三裂叶薯ItGATA16的亲缘关系最近，N端的锌指结构域序列高度一致，表明二者可能具有相似的功能。实时荧光定量结果表明，IbGATA16在甘薯根、茎、叶片等组织中均有表达，在叶中的表达量显著高于茎与根的表达量。IbGATA16对干旱和盐胁迫显著诱导表达，在干旱和盐胁迫处理0、...     

木薯MeSWEET10a基因启动子EBE区编辑载体的构建及验证

木薯细菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）是由地毯草黄单胞木薯萎蔫致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. Manihotis, Xam）引起的木薯重要病害,影响木薯产量,我国主栽的木薯品种均不抗Xam。Xam分泌的TAL20效应蛋白可结合木薯MeSWEET10a基因启动子的EBE区,激活该基因表达,促进糖类运输至Xam侵染的部位,为病菌的繁殖提供碳水化合物。本研究利用在线软件CRISPR-P v2.0设计EBE区的基因编辑靶点,构建CRISPR/Cas9基因编辑质粒pCAMBIA1301-Cas9-EBE-sgRNA。将重组质粒转化LBA4404根癌农杆菌,利用农杆菌介导法侵染木薯脆性胚性愈伤组织。提取侵染和未侵染的木薯脆性胚性愈伤组织DNA,PCR扩增靶点EBE区及潜在的脱靶位点,并进行Sanger测序分析编辑效果。结果发现EBE区被成功编辑,且没有脱靶现象。本研究有助于进一步获得MeSWEET10a基因启动子EBE区域的木薯突变体,以增强木薯抗细菌性枯萎病的能力。     

木薯MeCML24与MeSAUR1互作调控MeAGPS1a表达的功能验证

木薯是华南地区重要的经济作物,其块根富含淀粉。解析木薯块根淀粉合成调控机理将有助于木薯高产、高淀粉分子改良。AGPase由大亚基和小亚基构成,催化1-磷酸葡萄糖和ATP形成腺苷二磷酸葡萄糖和焦磷酸,其中腺苷二磷酸葡萄糖为淀粉生物合成的底物。AGPase酶是植物淀粉合成的限速酶,提高AGPase酶活性,有利于作物淀粉的积累及产量的提高。木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是AGPase的催化中心,前期研究表明生长素响应因子MeSAUR1作为转录因子正调控MeAGPS1a基因表达,酵母双杂交筛选木薯cDNA文库显示钙调素类似蛋白（CaM-like, CML）成员MeCML24为MeSAUR1的候选互作蛋白。为了确定MeCML24和MeSAUR1的互作关系,本研究从‘SC8’木薯品种基因组克隆了MeCML24基因,该基因的CDS区长度为492 bp,编码163个氨基酸。MeCML24蛋白的理化性质及二级结构分析显示,该蛋白理论等电点pI值4.38,属于亲水性蛋白,α-螺旋占52.76%,无规则卷曲占30.06%,β-转角结构占11.04%。构建酵母双杂交载体BD-MeCML24,自激活实验表...     

木薯种质资源中醇腈裂解酶基因12G132600编码区终止突变及频率的研究

木薯是重要的粮食作物,但块根中含有的氰苷及其产生的氢氰酸严重影响木薯的食用品质,增加加工成本。α-醇腈裂解酶（alpha-hydroxy nitrile lyase, HNL）是植物催化醇腈裂解产生氢氰酸的关键酶。重测序数据显示,‘华南8号’木薯品种中HNL编码基因家族的一个成员12G132600在编码区内部发生了终止突变,导致基因编码区变短。本研究对国内外251份木薯种质资源的重测序结果进行分析,共发现60份材料醇腈裂解酶基因12G132600存在相同的终止突变,该60份材料全部是终止突变与非终止突变的杂合基因型,且全部为栽培类型木薯。说明该突变是木薯由野生型驯化为栽培型以后发生的。通过对木薯品种‘华南9号’该基因的克隆测序以及与已发表的木薯品种‘TME3’基因组序列的比对分析,证实了该突变在木薯品种中真实存在。     

不同木薯品种对木瓜秀粉蚧抗氧化酶活性的影响

为了深入探讨木瓜秀粉蚧（Paracoccus marginatus）对木薯的选择性机理,本研究采用紫外分光光度法测定分析了木瓜秀粉蚧取食不同木薯品种1、2、4 d后体内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、过氧化物酶（peroxidase, POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）的活性差异。结果表明,木瓜秀粉蚧取食不同木薯品种后抗氧化酶活性存在显著差异,取食‘C1115’后其体内SOD活性最低,取食‘SC8002’后其体内CAT活性最低,取食‘SC8’后其体内POD和PPO活性最低。木瓜秀粉蚧取食木薯品种‘J1301’‘SC11’‘SC8002’‘东莞红尾’‘SC8’‘缅甸种’和‘C1115’后其体内SOD、CAT、POD和PPO活性在任一测定时间内和对照相比均显著降低。研究表明,上述木薯品种被木瓜秀粉蚧取食后能够通过抑制木瓜秀粉蚧体内抗氧化酶活性,干扰其正常活性氧代谢,可能对木瓜秀粉蚧具有抗性潜力。     

木薯UDP依赖型糖基转移酶14基因在木薯抗病性中的功能研究

木薯是热带和亚热带地区重要的经济作物和粮食作物,它不仅是近10亿人消费的第三大碳水化合物来源,也是工业淀粉和生物乙醇的主要资源之一。糖基化是一种广泛存在的修饰方式,它通过糖基转移酶（glycosyltransferase, GTs）来催化修饰反应。GTs以糖苷键的形式在底物分子上添加糖基来形成更加稳定的天然糖苷或糖酯,糖基主要包括葡萄糖、鼠李糖、木糖、半乳糖等。UDP依赖型糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases, UGTs）基因家族属于糖基化转移酶中的一类。UGTs基因在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用,其中最普遍的功能是转移反应,如植物中次生代谢产物（植物激素）的激活和影响相关物质的溶解度从而响应生物和非生物胁迫。为分析UGTs基因在木薯中的功能,本研究采用RT-PCR技术从木薯叶片（SC124）中克隆得到MeUGT14基因。MeUGT14基因的表达显著受到病菌（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis, Xam）的诱导。因此,构建MeUGT14基因的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）载体,沉默片段为285 bp。通过对木薯叶片进行基因沉默,qRT-PCR检测结果显示木薯叶片中MeUGT14基因的表达量显著下降。不同干扰植株中MeUGT14基因的表达量被不同程度地降低,分别降低了69%,45%和68%。随后对干扰植株和对照植株进行Xam侵染实验,接种Xam 6 d后,MeUGT14基因表达量的降低导致叶片上细菌数量显著增加,叶片表型也显示MeUGT14基因表达量的降低会导致叶片上菌斑更明显。研究结果表明干扰MeUGT14基因表达使得植株对Xam病菌侵染的抵抗能力显著降低。根据MeUGT14基因和UGT76B1/UGT74F1基因有较近的进化关系及UGT76B1/UGT74F1的功能研究,推测MeUGT14基因可能通过影响水杨酸和茉莉酸的合成来响应Xam病菌侵染。研究结果表明MeUGT14基因在木薯抵抗病菌侵染中发挥了作用,为进一步研究MeUGT14基因在木薯抗生物胁迫中的机制提供了线索。     

基于生氰糖苷降解途径基因表达特性的木薯品种对二斑叶螨的抗性机制初探

为初步探究生氰糖苷降解途径2个基因α-HNL和β-glu在木薯品种对二斑叶螨抗性中的作用,本研究以抗螨木薯品种‘C1115’‘缅甸’‘SC9’和感螨木薯品种‘SC205’‘面包’‘BRA900’为材料,分析木薯生氰糖苷降解途径基因及其编码的生化酶在二斑叶螨取食木薯品种不同部位叶片（上部、中部和下部）不同时间后（1、4 d）的表达量及酶活性的变化情况。结果表明,α-HNL在感螨木薯品种上部和中部叶片中的表达量随螨害时间的延长而显著降低;在抗螨木薯品种的不同部位叶片中,α-HNL的表达量均随螨害时间的延长而显著升高,并且以中部和下部叶片的升高趋势更为显著。β-glu在抗、感螨木薯品种不同部位叶片中的表达量均很低,难以比较该基因的表达量在不同木薯品种、不同部位叶片受螨害后的变化情况,但在能检测到的少量样品当中,抗螨木薯品种的占比也多于感螨木薯品种。进一步进行酶活性分析结果表明,抗螨木薯品种受螨害后,随着时间的延长,降解途径基因α-HNL编码的α-HNL酶活性呈逐渐升高或维持不变的趋势,并且以中部和下部叶片的升高趋势更为显著,而在感螨木薯品种中,随着螨害时间的延长,α-HNL酶活性则呈逐渐降低或先升高后降低的趋势;β-glu基因编码的β-GLU酶活性在不同木薯品种中均呈较低的水平,这可能与其对应编码的基因表达量低有关,但总体而言,降解途径2个基因编码的降解酶α-HNL和β-GLU在抗螨木薯不同叶片组织中的活性总体上也显著高于感螨木薯。本研究初步揭示了不同木薯品种受螨害不同时间后,生氰糖苷降解基因和酶可能与木薯对二斑叶螨的抗性有关。     

GA3处理对木薯类胡萝卜素生物合成的影响

木薯(Manihot esculenta Crantz)属大戟科木薯属热带作物,具有耐干旱贫瘠等特性,木薯叶片富含蛋白质,块根富含淀粉但是缺乏类胡萝卜素,是热带低收入人口的主粮.国家木薯产业技术体系"十三五"期间关于木薯产业问题指出,类胡萝卜素是粮饲化的重要指标,类胡萝卜素也是维生素A的前体物质.本文在前期研究中筛选到...