二穗短柄草钙依赖型蛋白激酶BdCDPK4基因的克隆及其编码蛋白质的生物信息学分析

二穗短柄草(Brachypodium distachyon L.)因与小麦、大麦等有很高的同源性,作为新型禾本科模式生物吸引了越来越多的研究者。试验采用基因克隆技术分离了二穗短柄草Bd CDPK4基因的编码区序列,并采用生物信息学方法分析了该基因及其编码的蛋白质的序列特征、结构和功能。结果表明,分离了BdCDPK4基因1 851 bp的cDNA序列(Gen Bank登录号为XM_003559516),编码区长度为1 752 bp,编码583个氨基酸,分子量为64.78 ku,等电点为9.12,含有N端可变区、蛋白激酶区、自抑制区、EF手型结构、类似钙调素等结构域。亚细胞定位预测位于叶绿体和液泡上。进化树分析结果显示,该蛋白与小麦Ta CDPK19蛋白的同源性最近。根据各物种间CDPKs蛋白的高同源性,结合小麦TaCDPK19基因被高盐和小麦白粉病菌Blumeria graministritici(Bgt)诱导,推测Bd CDPK4基因也可能参与逆境胁迫下的信号传导途径,在抗逆等生物学过程中发挥重要功能。     

甘蔗钙依赖蛋白激酶基因克隆与序列分析

[目的]克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因(ScCDPK1),为其功能解析和育种利用打下基础.[方法]根据甘蔗cDNA文库中的CDPK基因序列信息设计引物,利用RT-PCR克隆ScCDPK1基因,并采用在线生物信息学分析软件对其推导蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽及保守结构域等进行预测分析.[结果]克隆获得的ScCDPK1基因完整编码区大小1650 bp,编码549个氨基酸,相对分子量61.971 kD,等电点(pI)6.78,不稳定指数35.63.同源性和遗传进化树分析结果显示,ScCDPK1基因与小麦TaCPK7基因亲缘关系最近,同源性达88%;ScCDPK1蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域(可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区),其二级结构主要由α螺旋(42.80%)和无规则卷曲(32.97%)构成;蛋白功能分类预测结果显示,ScCDPK1蛋白是一种阳离子通道蛋白,可能参与植物胁迫应答、信号转导和翻译调控等生物反应.[结论]ScCDPK1基因编码的蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域,是一种阳离子通道蛋白.     

冀谷34中自噬相关基因SiATG5的克隆及响应干旱胁迫机理研究

自噬相关基因ATG5是植物应答逆境胁迫的一个关键基因。谷子SiATG5响应干旱的作用模式尚不明确。研究干旱胁迫下谷子中ATG5的表达模式,可揭示SiATG5在响应谷子抗旱中的作用。以谷子抗旱品种冀谷34为试材,克隆SiATG5;研究轻度干旱(PEG-6000浓度6%)、中度干旱(PEG-6000浓度18%)和重度干旱(PEG-6000浓度30%)胁迫下,SiATG5在冀谷34中的表达模式。结果表明:SiATG5全长1 092 bp,无内含子,编码363个氨基酸。预测分子量为40.3 kD,理论等电点为5.03,三级结构分析表明含有ATG5特有结构域,YLoc软件预测位于细胞质内。其SiATG5与高粱和玉米中的ATG5同源性最高。SiATG5在冀谷34中的表达结果分析表明,在轻度和中度胁迫下24 h内表达量逐渐升高;重度胁迫下6 h表达量达到最高,随后逐渐降低。中、重度胁迫下的表达量显著高于轻度胁迫下的表达量(P0.05)。SiATG5参与冀谷34的抗旱反应,为研究SiATG5在响应干旱胁迫中的作用及冀谷34抗旱机理奠定了基础。     

水稻B-box锌指蛋白基因OsBBX26的 克隆及表达分析

[目的]克隆水稻B-box锌指蛋白基因(OsBBX26),并分析其在非生物胁迫下的表达模式,为探究水稻B-box蛋白的非生物胁迫响应机制提供理论依据.[方法]以水稻模式品种日本晴为材料,采用RT-PCR克隆OsBBX26基因,对其进行生物信息学分析,并通过构建pBA-OsBBX26-YFP植物表达载体进行亚细胞定位.同时,采用实时荧光定量PCR检测分析OsBBX26基因的组织特异性及非生物胁迫(干旱、ABA、低温和高盐)下的表达模式.[结果]克隆获得的OsBBX26基因(LOC_Os08g42440)cDNA全长序列为1467 bp,编码488个氨基酸,其编码蛋白分子量为51.86 kD,理论等电点(pI)为6.63,包含1个B-box锌指结构域和1个CCT结构域,其中B-box结构域位于第13~60位氨基酸,CCT结构域位于第435~478位氨基酸,该蛋白定位于细胞核中.OsBBX26基因位于8号染色体上,启动子区域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本转录元件外,还含有与逆境相关的顺式作用元件,包括低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,以及MYB转录因子结合位点.OsBBX26蛋白与粳稻B-box蛋白亲缘关系最近,其次与籼稻B-box蛋白亲缘关系较近,与其他植物B-box蛋白也存在较高的相似性,其中与小米、大麦、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分别达72%、72%、71%、69%和68%.OsBBX26基因在幼叶中的表达量最高,其次是在成熟叶片中,在幼根、成熟根、茎和幼穗中的表达量均极低,表明该基因表达具有明显的组织表达特异性.干旱、高盐、ABA和低温胁迫处理下OsBBX26基因均上调表达,干旱、高盐和ABA胁迫处理12 h达峰值,但低温胁迫处理在24 h后才达峰值.[结论]OsBBX26基因受干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导均上调表达,推测其参与水稻植株响应多种非生物胁迫,在逆境响应中发挥重要调控作用.     

木薯NAC转录因子Rd26基因克隆及表达

【目的】克隆木薯NAC转录因子Rd26基因(MeRd26)并检测其在干旱胁迫下的表达量,为Rd26基因抗旱调控机制研究打下基础。【方法】利用反RT-PCR克隆木薯叶片中的MeRd26基因,对其进行序列比对及系统发育进化树构建,研究其在栽培种Ku50和野生种W14间的变异情况,并用实时荧光定量PCR(qPCR)检测PEG-6000干旱胁迫下的MeRd26基因表达量。【结果】从木薯叶片中克隆获得的MeRd26基因,长度为1288 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸,且含NAC保守结构域。系统发育进化树分析结果表明,MeRd26蛋白与杨树(Potri.011G123300.1)和杞柳(SapurV1A.0127s0020.1)的Rd26蛋白亲缘关系较近。基因结构变异分析结果显示,MeRd26基因有33个SNP位点和7个InDel位点,且大部分变异分布在非编码区及最后一个外显子的后半区域。基因表达检测结果显示,在正常大田种植条件下,栽培种Ku50叶片的MeRd26基因表达量是野生种W14的130倍,但在根中表达量差异较小;在干旱胁迫下,栽培种Ku50未展开叶、老叶和根中MeRd26基因表达被快速诱导,表达量随胁迫时间的延长而增加,在根中表达量最高,但在第1片完全展开叶中,MeRd26基因的表达被抑制,其表达量明显降低。【结论】MeRd26基因在转录水平上参与了木薯抗干旱胁迫反应,可作为候选基因用于木薯抗旱机制研究。     

甘蔗ATP结合蛋白基因克隆及其干旱胁迫下的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗ATP结合蛋白基因,分析其基本生物学信息及在干旱胁迫下的表达特性,为ATP结合蛋白的功能研究提供理论依据.[方法]从乙烯诱导甘蔗差异表达转录组和水分胁迫下甘蔗cDNA文库中获取ATP结合蛋白基因序列,设计其引物进行RT-PCR扩增,利用生物信息学软件进行序列分析及其蛋白结构和功能预测,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测干旱胁迫处理下的甘蔗ATP结合蛋白基因的表达情况.[结果]克隆获得的甘蔗ATP结合蛋白基因全长2145bp,编码714个氨基酸,其蛋白分子质量为79.430kD,理论等电点(pI)为9.33,不稳定系数为44.38;甘蔗ATP结合蛋白与玉米ATP结合蛋白的核苷酸序列及其推导氨基酸系列同源性最高,均达93%.甘蔗ATP结合蛋白主要由无规则卷曲(42.02%)、α螺旋(25.63%)和延伸链(22.27%)结构组成,具有蛋白激酶催化结构域、ATP结合位点、核苷酸结合位点(NBS)、糖基化位点、激酶磷酸化结合位点及核定位信号等;甘蔗ATP结合蛋白可能主要定位在细胞核、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中,起中间代谢调控作用,或参与转录调控、免疫应答、胁迫应答及信号转导等生物反应.qPCR检测结果显示,在干旱胁迫7d后,甘蔗ATP结合蛋白基因的表达量明显下调,约为对照的30%,恢复正常供水(复水)后,表达量回升.[结论]甘蔗ATP结合蛋白基因表达受干旱胁迫诱导,可能参与甘蔗对干旱逆境胁迫响应的代谢调控.     

木薯SCARECROW-LIKE(SCL)基因克隆、生物信息学及非生物胁迫下表达分析

[目的]克隆木薯SCARECROW-LIKE(MeSCL)基因,对其进行生物信息学分析,并检测其在非生物胁迫下的表达情况,为深入研究木薯MeSCL基因响应非生物胁迫的调控机制提供理论参考.[方法]以木薯品种D346为材料,采用RT-PCR克隆MeSCL基因编码区(CDS)序列,并利用生物信息学分析软件进行序列特征分析,采用实时荧光定量PCR检测其在干旱、盐、氧化和低温胁迫下木薯叶片中的表达情况.[结果]克隆获得的MeSCL基因编码区(CDS)序列全长1655 bp,与参考序列(GenBank登录号LOC110627921)仅存在2个碱基的差异,开放阅读框(ORF)的长度为1560 bp,编码519个氨基酸,编码蛋白分子量为57.84 kD,等电点(pI)为6.08,脂肪系数为80.46%,总平均亲水性指数为-0.195,为亲水性蛋白,含有1个信号肽、6个从内部到外部的跨膜螺旋区和5个从外部到内部的跨膜螺旋区,定位于细胞核和内质网中,属于GRAS蛋白家族成员,具有该家族的保守结构域.MeSCL蛋白三级结构模型显示,该蛋白含有14个典型的α螺旋、10个β-折叠和36个β-转角.MeSCL蛋白与橡树HbSCL蛋白的相似性最高,为90.80%,与蓖麻RcSCR、胡杨PeSCL、毛果杨PtSCR、可可树TcSCR和哥伦比亚锦葵HuSCL蛋白的相似性在80.00%左右.MeSCL基因受干旱、盐、氧化和低温胁迫诱导表达量整体呈升高趋势,但在不同处理时间的表达量存在明显差异,其中,干旱和氧化胁迫下,MeSCL基因均在处理24 h时表达量最高,分别是对照的6.05和11.17倍,而盐和低温胁迫下,MeSCL基因均在处理6 h时表达量最高,分别是对照的11.76和3.80倍.[结论]MeSCL基因参与木薯植株的非生物胁迫响应,正向调控其抗非生物胁迫能力.     

二穗短柄草BdGPX4基因的克隆及酶学性质

为解析模式植物二穗短柄草中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)在抗氧化过程中的作用机制,对二穗短柄草BdGPX4基因进行克隆,获得681bp的cDNA序列,该基因编码226个氨基酸残基的蛋白质,预测相对分子量是24.49ku。通过亚细胞定位预测,BdGPX4蛋白位于叶绿体和线粒体中。生物信息学分析发现BdGPX4基因启动子具有植物激素、光信号、干旱以及冷胁迫响应元件。结合二穗短柄草基因芯片数据和RT-PCR表达检测结果,发现BdGPX4基因在根、茎、叶、叶鞘、苗芽、穗状花序和种子等部位均表达,在光合组织和生长旺盛部位的表达显著高于非光合和衰老部位,并在根部受到SA诱导表达上调。成功构建BdGPX4基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化BdGPX4蛋白,检测到对H_2O_2和COOH具有较高活性,但对底物tBOOH活性较低,与直系同源蛋白OsGPX4相比功能发生分化。基因表达模式及酶学活性的特点预示着二穗短柄草BdGPX4基因在光合器官和胁迫条件下具有重要的抗氧化作用。     

木薯赤霉素途径DELLA蛋白基因克隆及其对干旱胁迫的响应

赤霉素(GA)信号转导途径是通过DELLA抑制蛋白来调控的.笔者利用拟南芥DELLA蛋白基因序列,通过电子克隆方法首次克隆了1个木薯DELLA蛋白基因,长度为1 857 bp,具有完整的蛋白编码框的cDNA序列,命名为MeGAI.生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥DELLA蛋白一样的保守结构域,如DELLA结构域、VHYNP结构域、POLY(S/T)结构域、核定位信号、VHVID结构域、亮氨酸结构域、GRAS结构域;该基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,该基因在干旱胁迫下是下调表达的;GA生物合成重要基因GA20-氧化酶基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,两者在干旱胁迫下的表达模式具有良好的相关性,这说明GA途径可能参与木薯抗旱机制.     

马铃薯PPR蛋白家族基因SoDIPPR的克隆及其在干旱条件下的表达特征分析

【目的】PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白家族在植物的生长发育、细胞器形成、细胞质雄性不育的育性恢复、RNA的编辑加工、细胞核与细胞器之间信号传递、逆境防御等方面具有重要作用。研究旨在了解PPR蛋白家族SoDIPPR基因在马铃薯中的表达情况及其在干旱胁迫下的作用。【方法】以抗旱马铃薯二倍体品系H145为材料,利用cDNA-AFLP技术寻找与抗旱性密切相关的基因cDNA片段,利用RACE技术克隆其基因全长cDNA,并利用半定量RT-PCR和Northern杂交法研究其在干旱条件下的表达情况。【结果】从抗旱马铃薯二倍体品系H145中克隆了一个836bp全长cDNA序列,命名为SoDIPPR,该序列开放阅读框长为588bp,编码195个氨基酸序列。序列分析表明,SoDIPPR蛋白存在PPR结构域、激酶结合区、和C端SMR（small MutS related protein）区域。SoDIPPR蛋白序列与GenBank数据库中的其它PPR蛋白进行同源序列比对,构建系统进化树,发现SoDIPPR与其它14个高等植物的PPR蛋白同源性为57％-82％,与苜蓿DNA错配修复蛋白MuTs2、水稻盐诱导蛋白（Q9LS25）和叶绿体RNA结合蛋白（Q75IP8）的同源性达69％-82％。半定量RT-PCR和Northern杂交结果表明,SoDIPPR基因在干旱胁迫下叶片和根系里的表达量明显增加,说明SoDIPPR基因在马铃薯抗旱中起一定作用。在持续干旱条件下,SoDIPPR基因在抗旱品系H145与干旱敏感品系H214中表达模式不同。【结论】马铃薯SoPIPPR基因编码的蛋白与其它植物PPR家族蛋白同源性较高,SoPIPPR基因参与马铃薯对干旱胁迫的应答反应,可能对抵抗干旱胁迫有一定作用。     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Se-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得sc．ERS启动子序列1410bp,该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82％和80％。PlantCARE在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA．BOX和CAAT—BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测sc．ERS;~因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗的构建及鉴定

[目的]构建含鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK抗原基因及鸡IFN-γ基因的三价DNA疫苗。[方法]应用SOE-PCR将3-1E、CD-PK和鸡IFN-γ共3个基因通过2个（GGGGS）3连接子相连,扩增出IFN-γ/3-1E/CDPK三价融合基因,将其克隆入真核表达载体proVAX中构建三价融合真核表达质粒proIEC,后用双酶切和PCR进行鉴定。阳性重组质粒提取纯化后体外转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达情况。[结果]经双酶切和PCR鉴定证实鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗构建成功,且在PK-15细胞中获得了成功表达。[结论]鸡柔嫩艾美耳球虫IFN-γ/3-1E/CDPK三价DNA疫苗构建成功,为进一步探讨其免疫保护性奠定了基础。     

甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗体内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因,分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析,为进一步探讨SoNCED基因在甘蔗脱落酸(ABA)生物合成途径中的作用提供理论依据.[方法]以甘蔗品种桂糖21号为材料,待蔗苗长至5~6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理,利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA未端快速扩增(RACE-PCR)克隆SoNCED基因,应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析SoNCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况.[结果]克隆获得的SoNCED基因(GenBank登录号JQ314108),cDNA全长为2521 bp,包含1个1827 bp的开放阅读框(ORF),编码608个氨基酸.多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明,SoNCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性,尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高,均达96%.成功构建SoNCED基因的原核表达载体pET-SoNCED,且通过IPTG诱导时可得到约66.0 kD的蛋白,确定该蛋白为SoNCE基因的表达蛋白.qRT-PCR结果分析表明,SoNCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达,其中氧化胁迫下其表达量在6h时达峰值,其他胁迫方式下其表达量在12h时达峰值.[结论]成功克隆获得甘蔗SoNCED基因,并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程.     

甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆与生物信息学分析

[目的]克隆甘蔗MAP激酶家族新基因的全长序列,为了解甘蔗抗逆胁迫机制提供依据.[方法]以新台糖22为材料,提取甘蔗幼叶总RNA并反转录为cDNA;利用已知物种MAP激酶基因核苷酸序列保守区设计引物,采用5′和3′端RACE技术克隆新基因全长,并进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的甘蔗新基因与玉米ZmMAPK4同源性很高,达92.6%,将该基因命名为SoMAPK4(登录号JQ062930),基因全长1499 bp,其中开放阅读框(ORF)为1128 bp,5′非翻译区(UTR)为218 bp,3′非翻译区(UTR)为213 bp.生物信息学分析结果表明,SoMAPK4基因编码一个含376个氨基酸的蛋白质,分子量约43.5 kDa,等电点为5.51,含有11个保守的蛋白激酶亚区和MAP激酶的磷酸化位点TEY基序.[结论]克隆获得甘蔗MAP激酶新基因SoMAPK4,该基因可能参与多种胁迫反应的信号传递,是研究甘蔗非生物胁迫和生物胁迫过程中信号传递的一个关键因素.     

Cloning and Bioinformatics Analysis of zmERECTA

[Objective] This study was conducted to clone zmERECTA gene according to Arabidopsis ERECTA sequence and predict its characteristics by bioinformatics. [Method] The c DNA of zmERECTA gene was isolated from B73 using RT-PCR, and analyzed by bioinformatics methods. [Result] zmERECTA gene was 2 985 bp in size, which encoded a protein consisting of 944 amino acids, containing leucine-rich repeats, a PKC domain, two transmembrane regions, 14 N-glycosylation potential sites and41 kinase specific phosphorylation sites. The theoretical p I and molecular weight of zmERECTA protein was 6.01 and 10 8495.5respectively. [Conclusion] Cloning and bioinformatics of zmERECTA gene laid a foundation for further research.