野生木薯中蔗糖合酶基因I的启动子克隆与调控区域鉴定

克隆了野生木薯蔗糖合酶I基因的5′侧翼序列,发现其5′UTR区存在一个前导内含子,为了探究该基因启动子的调控区域以及前导内含子的可能功能,构建了6个侧翼序列梯度缺失载体并转化烟草。结果表明:野生木薯蔗糖合酶I基因的前导内含子可单独起始基因的转录,部分启动子序列的缺失会对基因的转录活性产生较大影响;不同缺失载体烟草转化株响应ABA的程度和方向存在差异,可能与ABA响应相关顺式作用元件的分布以及启动子序列与前导内含子的互作相关。该结果将会对木薯蔗糖合酶I基因的遗传改良提供理论指导。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

枇杷鲨烯合酶(Squalene synthase)基因的克隆及序列分析

鲨烯合酶(SQS)是枇杷三萜酸生物合成过程中的关键酶。以枇杷(Eriobotrya japonica L.)悬浮培养细胞为材料,采用RT-PCR和RACE方法分离得到枇杷鲨烯合酶Ej-SQS(Squalene synthase)基因的cDNA全长序列(GenBank,JQ294055),共1 775 bp,包含了5′非编码区为97 bp,开放阅读框为1 239 bp,3′非编码区为439 bp。该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含412个氨基酸)与其它植物SQS具有79%~94%同源性,包含Trans_IPPS_HH保守结构域,可能属于Isoprenoid Biosynthesis enzymes,Class 1家族。为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。     

木薯查尔酮合酶MeCHS基因家族特征与表达分析

查尔酮合酶（chalconesynthase,CHS）是类黄酮合成途径的第一个限速酶,在植物花色形成、生长发育以及非生物胁迫中发挥着重要作用。为明确木薯MeCHS基因家族的特性及在木薯块根采后腐烂（PPD）中的表达,本研究利用生物信息学方法对木薯MeCHS基因家族成员进行理化性质、蛋白质结构等分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeCHS基因在不同品种、不同组织及块根PPD过程中的表达情况,同时克隆并构建3个高表达的MeCHS基因的亚细胞定位载体并进行烟草瞬时转化以确定其定位。在木薯基因组中共鉴定出5个MeCHS基因家族成员,蛋白质二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主。qRT-PCR分析发现：MeCHS基因表达具有明显的组织特异性,在茎中表达水平最高;在木薯中主要表达的MeCHS基因为MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3,且3个基因随着SC8块根贮藏时间的延长表达量逐步升高。将成功克隆得到的MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3基因经农杆菌介导瞬时转化烟草下表皮细胞,显微观察表明3个基因均定位于细胞质,与预测结果相符。该研究结果可为进一步揭示木薯MeCHS基因家族的功...     

海南龙血树查尔酮合酶基因(DcCHS)的克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE技术对海南龙血树查尔酮合酶基因进行克隆,得到1条1 456 bp的cDNA序列,命名为DcCHS。DcCHS含有1 173 bp的阅读框架、99 bp的5′非编码区和184 bp的3′非编码区,编码390个氨基酸。DcCHS与其他植物的CHS氨基酸序列同源性高达84%以上,具有高度保守的CHS_like结构域、活性位点以及信号序列。推测DcCHS的分子量为42.7 ku,等电点pI为6.14,稳定性极差,具有15个磷酸化位点,无跨膜结构,无信号肽,亚细胞定位在细胞质的可能性较大,并预测了蛋白质的二级、三级结构。组织特异性分析结果表明,DcCHS在花中的表达远远高于根、茎、叶和果实。     

芪合酶基因的克隆与植物表达载体的构建

为获得含白藜芦醇且具有保健作用的转基因番茄，进行了芪合酶基因克隆、植物表达载体构建及导入受体细胞的研究。从葡萄2个品种——雷司令和粉红玫瑰的叶片中提取基因组DNA，并以其为模板，经PCR扩增芪合酶基因，各获得一长约1．6Kb的片段，将这2个片段分别连接到pGEM-Teasy和pUCm-T上进行测序，1个片段长为l622bp(命名为S1)，另一个片段长为l617bp(命名为S2)。然后将Sl正向插入pEV2的果实特异性启动子TFP2和NOS终止子，构建了植物表达载体pEV2S1；将S2正向插入植物表达载体pBll2l的35S启动子和NOS终止子之间。构建了植物表达载体pBS2．将重组体pEV2S1和pBS2转化大肠杆菌E．coli XLl，并对重组体进行了筛选和鉴定．     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

哈姆林甜橙蔗糖合酶Ⅰ和酸性转化酶基因表达与果实糖积累的关系

蔗糖合酶(Sucrose synthase,SS)与酸性转化酶(Acid invertase,AI)是甜橙糖代谢过程中的两个关键酶,SS催化尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖和果糖合成蔗糖的可逆反应,AI则不可逆的催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖,它们在甜橙糖代谢过程中起着重要作用。笔者以哈姆林甜橙品种为试验材料,采用半定量RT-PCR法,对4个时期哈姆林叶片中的SSI基因和AI基因的表达进行了分析。结果表明,4个时期哈姆林叶片中均可检测到SSI基因和AI基因在转录水平上的表达,但表达量存在差异。SSI基因在果实发育过程中表达量呈低-高-低-高趋势。AI基因在哈姆林果实发育成熟过程中的表达逐渐减弱,与果实糖累积呈负相关。     

木薯蔗糖转运蛋白基因的表达分析

以木薯SC124为材料,分别在植株发育8个时间点取其块根和功能叶,利用实时定量PCR技术（qPCR）对木薯SUT1、SUT2、SUT4三类蔗糖转运蛋白基因表达差异进行研究。结果表明,在木薯块根形成期（90 d）3类SUT表达的日变化中,功能叶和块根中均以中午12 h最高,其余时间较低,叶片中SUT1和SUT2表达水平较高而块根中差异不显著;在整个发育过程中,叶片表达水平高于块根,且二者均为前期表达水平高,后期下降,3个SUT之间的表达量也有着明显的差异,叶片中SUT1的表达量最高,其次是SUT2,SUT4最低,在块根中除60 d时SUT1的表达量较高外,其它SUT表达量均较低,SUT4在叶片和块根中的表达量差异不大。     

四倍体小麦Langdon HMT1基因的克隆及原核表达

硒是人类不可缺少的重要微量元素之一,人类必须补充足够的硒才能保证身体健康。同型半胱氨酸甲基转移酶(homocysteine-S-methyltransferase,HMT)基因与植物富硒关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶(selenocysteine methyltransferase,SMT)基因同源。为了发掘并利用麦类作物中的富硒关键酶基因,基于NCBI已公布的节节麦(Aegilops tauschii Coss.)同型半胱氨酸甲基转移酶1基因(AetHMT1)的序列设计HMT1基因的特异性引物H1-F/H1-R,克隆四倍体小麦Langdon HMT1的开放阅读框(open reading frame,ORF)后进行序列分析,并通过原核表达验证该基因。结果表明,利用H1-F/H1-R从四倍体小麦Langdon(LDN)克隆出两条长度均为975bp的序列,分别命名为LDNHMT1-1和LDNHMT1-2。LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与AetHMT1基因一样,均编码342个氨基酸,分子量大小分别为35.19kDa和35.18kDa。通过氨基酸序列比对和进化树分析发现,LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与其他HMT、SMT有较高的相似性。构建原核表达载体,并通过SDS-PAGE鉴定,成功获得LDNHMT1-1、LDNHMT1-2的原核表达菌株,且原核表达的蛋白质与预测分子量大小一致。     

巴西橡胶树蔗糖磷酸合成酶基因的克隆和表达分析

分析橡胶树EST数据库,得到一个注释为SPS(蔗糖磷酸合成酶)的EST序列重叠群(contig).通过PCR扩增和测序技术获得该基因的全长cDNA和基因组序列,命名为HbSPS1.序列分析显示,HbSPS1基因长度为5 298 bp,包含13个外显子和12个内含子.对应的cDNA编码序列(CDS)为3 156 bp,推测编码1 050个氨基酸,分子量大小为118.1 ku,等电点为6.05.采用荧光定量PCR技术分析该基因的表达模式,结果表明,HbSPS1基因主要在胶乳中表达,在乙烯利和机械伤害处理的胶乳中呈下调表达,在割胶影响下略有上调表达趋势,同时该基因在叶片发育过程中呈上调表达.说明HbSPS1基因可能参与胶乳蔗糖代谢和叶片发育调控.     

巨桉EgrWRKY70基因克隆和初步表达分析

WRKY家族为植物所特有,参与调控植物逆境胁迫、生长发育和衰老等生物学过程。为了获得WRKY70同源基因在桉树响应胁迫中的作用和功能,克隆巨桉(Eucalyptus grandis)中的Egr WRKY70基因,通过生物信息学分析和q RT-PCR进行功能的初步鉴定。结果表明,Egr WRKY70基因编码321个氨基酸,蛋白分子量为36.18 ku,只有一个WRKY结构域,属于WRKY转录因子III a类成员。同时,Egr WRKY70与麻风树的Jcu WRKY70的亲缘关系最近,其氨基酸序列相似性达到58.2%。半定量RT-PCR分析表明,Egr WRKY70主要在巨桉叶片、根和花中表达,而在茎部表达量较低。实时定量q RT-PCR分析显示:Egr WRKY70基因在低温和盐胁迫下,表达量快速升高然后下降;在盐胁迫下Egr WRKY70基因表达仍然维持在较高水平;在油菜素内酯和水杨酸处理时,Egr WRKY70基因能够快速的响应,使用茉莉酸甲酯处理时其表达量没有发生明显的变化。由此表明,Egr WRKY70能够通过不同的响应方式参与桉树生物和非生物胁迫的应答。     

小麦 TaCP3基因的克隆及其参与非生物胁迫的表达分析

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)是植物中重要的蛋白酶家族之一,广泛参与植物的各种生理过程;TaCP3属于papain-like(木瓜蛋白酶)家族的半胱氨酸蛋白酶,在小麦的生长发育及抗逆中起到重要作用。为研究 TaCP3基因的结构特征,以及在干旱、高盐、低温和高温胁迫下的表达情况,从小麦抗旱品种西农538中克隆了 TaCP3基因,该基因仅含1个1125 bp的开放阅读框,编码374个氨基酸,在蛋白氨基端有一个28个氨基酸残基组成的信号肽,羧基端具有木瓜蛋白酶亚家族的保守结构域。生物信息学分析表明, TaCP3与大麦和山羊草半胱氨酸蛋白酶基因相似性最高。同时,本研究构建了pcold-TF/TaCP3原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达了TaCP3重组蛋白,分子量约为40 kD。qRT-PCR结果表明, TaCP3的表达对干旱、高盐、低温和高温胁迫均有响应,初始都呈先降后升的趋势;且对干旱胁迫有强烈的正向响应。     

金花茶体细胞胚胎Cn-SERK基因的克隆及其生物信息学分析

以金花茶体细胞胚胎为材料,采用RT-PCR和RACE技术,获得了含有完整开放阅读框的金花茶Cn-SERK基因cDNA全长序列和DNA全长序列。Cn-SERK基因编码1个含有624个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示该蛋白质为亲水、且具有信号肽的跨膜蛋白,定位于内质网的可能性最高。二级结构主要有α螺旋和无规则卷曲构成,存在1个蛋白激酶位点。此蛋白可能发生磷酸化的位点有25个。内含子分析结果表明,Cn-SERK基因由11个外显子和10个内含子组成,内含子的剪切位点符合真核生物GT-AG规则。系统进化树分析结果     

木薯转化酶抑制子MeINH3基因的克隆及生物信息学分析

转化酶抑制子调控转化酶的活性,在植物的糖代谢过程中具有重要作用。为了研究木薯的转化酶抑制子,本实验利用木薯基因组数据库分析及RT-PCR方法,从木薯中分离了1个木薯转化酶抑制子MeINH3的cDNA序列。MeINH3序列长度为564 bp,包含528 bp的完整开放阅读框,编码127个氨基酸,N端有16个氨基酸残基的信号肽,4个保守的半胱氨酸残基可形成两个二硫桥。亚细胞定位预测表明,MeINH3蛋白定位于胞外。根据生物信息学分析结果,推测其可能抑制木薯细胞壁转化酶活性。     

象耳豆根结线虫Me-mapk1基因的克隆及RNAi分析

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是线虫体内信号转导的重要组分,在生长发育过程中具有重要作用。本研究从象耳豆根结线虫中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1c DNA序列,该序列全长1 369 bp,包含1个1 185 bp的完整开放阅读框,推导编码394个氨基酸,蛋白质分子量为45.39 ku。同源性搜索比对结果发现,该基因编码的蛋白序列与南方根结线虫MI-MAPK1具有99%的一致性。通过构建原核表达载体p ET-32a-MAPK,在IPTG的诱导下得到70 ku左右的特异融合蛋白(包括大小约26 ku的标签序列)。利用RNAi技术对象耳豆根结线虫二龄幼虫Me-mapk1基因进行沉默,线虫诱导番茄根结形成的数量显著减少,推测Me-mapk1基因的下调表达有可能影响象耳豆根结线虫二龄幼虫(J2)的生长发育。