牙鲆Mx基因的克隆及序列分析

对牙鲆(Paralichthys lethostigma)总RNA经反转录得到的cDNA测序。结果表明,获得的cDNA片段全长1 980 bp,其中编码区长1 890 bp,编码629个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为71.7 kDa。Blast比较以及Megalign软件分析的结果表明,此cDNA片段具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域;一个发动蛋白家族的典型结构特征序列及C端高度保守的Leu拉链结构区。进一步的序列比较与进化分析结果表明,牙鲆Mx基因与日本比目鱼等鱼类的同源性较高,同源性达75.1%-98.7%;而与哺乳动物的同源性相对较低,同源性达50.3%-55.1%。     

猪Mx1基因cDNA的克隆及序列分析

 为获得云南本地猪Mx1基因cDNA序列,根据GenBank中猪Mx1基因的参考序列,设计合成3对引物。以云南本地猪外周淋巴细胞为样本,采用RT-PCR方法进行分段扩增,对扩增片段进行克隆,测序分析及序列拼接。结果表明,扩增的云南本地猪Mx1基因cDNA全长2546bp,开放阅读框1992bp,编码663个氨基酸,与GenBank中他猪种Mx1基因序列对比,核苷酸序列的同源性为99.4%～99.8%,氨基酸序列的同源性为98.8%～99.5%。成功获得云南本地猪Mx1基因的cDNA序列,为研究云南本地猪Mx1蛋白的抗病毒活性及作用机制奠定了基础。     

苹果L-半乳糖脱氢酶基因 cDNA全长的克隆与序列分析

L-半乳糖脱氢酶(L-Galactose dehydrogenase,GalDH)是维生素C合成的L-半乳糖途径中,催化L-半乳糖生成L-半乳糖内酯的关键酶。根据GenBank中登录的的GalDH cDNA序列设计1对扩增引物,以嘎拉苹果叶片为材料,采用RT-PCR法扩增出GalDH cDNA全长。将获得的基因片段克隆到pMD18-T载体上,转入大肠杆菌DH5α筛选阳性克隆,经酶切和PCR鉴定,并对插入片段进行序列分析,结果表明,本试验获得的cDNA片段长为1 111 bp,是苹果GalDH cDNA全长。     

油茶FBPase基因的全长cDNA克隆及序列分析

FBPase是调控Clavin循环的关键酶之一,加速Clavin循环有利于提高植物的光合效率.在油茶cDNA文库和EST文库构建的基础上,以油茶“湘林1号”的近成熟种子为材料,采用5'RACE和3'RACE技术克隆油茶FBPase基因的全长cDNA序列;该基因全长cDNA序列为1 356 bp,其中开放读码框为1 02...     

杜仲肉桂醇脱氢酶基因全长cDNA克隆及序列分析

以杜仲(Eucommia ulmoides Olive)4、5月份新长成的杜仲幼嫩叶片为材料,在克隆一段肉桂醇脱氢酶(cin-namyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因的基础上,以杜仲cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增法(Rapid ampli-fication of cDNA Ends,RACE)克隆了5’端828 bp和3’端798 bp cDNA序列,经5’RACE产物和3’RACE产物序列拼接,获得全长为1243bp的杜仲CAD cDNA序列,开放阅读框编码243个氨基酸,命名为EuCAD(GenBank登录号:DQ142643)。与GenBank中序列比对分析发现,该cDNA序列与苹果树、桉树、红橡树中的CAD基因序列同源性均为81%,预测编码的氨基酸序列与苹果树、桉树、红橡树的同源性分别为73%、70%和70%,因此认为是杜仲肉桂醇脱氢酶基因。该基因为首次从杜仲中克隆,为探索木质素的合成调控机理奠定基础。     

桑树白藜芦醇合酶基因全长克隆及序列分析

根据已知的其他物种白藜芦醇合酶cDNA保守序列设计引物,用RT－PCR技术从桑葚中扩增获得白藜芦醇合酶基因部分cDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列,并拼接得到完整的1442 bp白藜芦醇合酶基因。经序列分析发现,桑树白藜芦醇合酶基因开放阅读框长1170 bp,编码389个氨基酸,氨基酸序列含有芪合酶家族特征信号区GVLFGFGPGLT和活性中心序列GCFAGGTVLR;该基因与花生芪合酶基因的核苷酸序列同源性高达82．82％,氨基酸序列的同源性高达87．15％。     

鸭LXRα基因cDNA的克隆及序列分析

为鸭肝X受体α(LXRα)基因表达、结构功能及其在鸭脂代谢信号传导中的相关研究莫定基础资料,以兴义鸭肝脏组织总RNA为模板,采用RT-PCR法对LXRα基因进行扩增测序,分析其序列特征.结果表明:鸭LXRα基因扩增产物克隆拼接的cDNA序列全长为1412 bp(GenBank登录号:FJ966078),编码区(CDS)长1230 bp,包含起始密码子ATG和终止密码子TGA,编码409个氨基酸残基的LXRa锌指蛋白,含有17个磷酸化位点、3个糖基化位点、2个锌指结构(P-box和D-box)和1个配体结合区(LBD),无跨膜螺旋结构,表现出典型的核激素受体超家族的结构特征.鸭LXRα蛋白与哺乳动物和鱼类的LXRα蛋白的同源性为73%～76%,与禽类的同源性高达97%左右,说明LXRα基因在系统进化过程中具有很高的保守性.     

鸡传染性支气管炎病毒H52毒株S基因的克隆及序列分析

将含有鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52毒株的尿囊液浓缩,用TRIzol 试剂抽提病毒RNA作为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的模板,参照已发表的IBV-Beaudette 株S基因序列,设计并合成一对特异性引物,扩增得到长度约3.6 kb 的S基因片段,利用引物设计中EcoR I和BamH I 酶切位点插入到克隆载体pBlueScript SK 的多克隆位点中,转化感受态E.coli DH5α.经酶切分析和PCR等方法鉴定,筛选出阳性克隆,进行核苷酸序列测定,证实获得了S 基因的全长序列.利用DNAstar等分析软件与GenBank中其它IBV毒株的核苷酸及其推导的氨基酸进行序列同源性比较分析,结果表明,H52毒株与已报道的核苷酸的同源性在83.45%～99.71%之间,氨基酸的同源性在82.10%～99.26%之间.     

固始鸡白细胞介素2 cDNA的克隆及序列分析

参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经conA诱导的20~35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出基因片段.将其连接到克隆质粒pGEM-T,转化JM109,选择培养基筛选,酶切和测序鉴定,证明克隆基因为鸡白细胞介素2基因.与已公布的崇仁麻鸡、印度肉鸡、丝毛鸡、来杭鸡、仙居鸡、肖山鸡品种IL-2基因序列比较,在ORF内有2个核苷酸发生变异,其核苷酸序列同源性分别为:99.3%,99.1%,98.4%,99.3%,98.6%,99.5%;其编码的氨基酸序列同源性分别为:97.9%,97.9%,95.8%,97.9%,96.5%,98.6%.     

琅琊鸡Mx基因3'端部分序列PCR-RFLP与序列分析

[目的]为琅琊鸡分子标记辅助选择、抗病育种提供依据。[方法]利用PCR-RFLP技术对琅琊鸡Mx基因3’端片段的HaeIII的酶切多态性进行分析。[结果]琅琊鸡群体中存在Mx基因Haem酶切位点的多态性,且均有A、B2个等住基因,基因频率分别为0．562和0．438。Mx基因Hoe III酶切位点的基因型分布在琅琊鸡群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P〈0．01）。对多态片段进行克隆测序分析,结果表明,该扩增片段长度大小为357bp,多态片段存在长度为31bp的碱基缺失。[结论]在山东省地方鸡种琅琊鸡眠基因3’端序列中发现存在Hoe III-RFLP。     

鸡、鹅肌肉生成抑制因子基因的克隆及序列分析

采用反转录．聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从鸡胚、鹅胚中扩增得到肌肉生成抑制因子基因,分别克隆到pGEM-T Easy载体中进行序列测定．结果表明,克隆得到的MSTN基因序列均由1128个核苷酸组成,MSTN基因序列同源性为94．6％,推导相应氨基酸序列的同源性达97．9％．     

人胎盘TRAIL基因的cDNA克隆及序列测定

根据GeneBank(U37518)中TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)的cDNA序列,设计扩增引物。采用RT-PCR从人胎盘中扩增出TRAIL基因的全长cDNA。产物纯化后连至pGEM-TEasy载体,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆菌,酶切鉴定并进行序列测定。结果表明,本试验成功地克隆了TRAIL基因的1039bp全长cDNA。     

鸡白细胞介素-2 cDNA克隆

用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ。以ＣｏｎＡ（２０μｇ／ｍＬ）诱导ＳＰＦ鸡脾脏淋巴细胞,第２０小时收集细胞,提取ｍＲＮＡ,以ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒合成ｃＤＮＡ,定向连结于穿梭质粒ｐＳＶ·ＳｐｏｒｔⅠ,构建ｃＤＮＡ文库。将文库分组提取重组质粒,转染ＣＯＳ－７细胞,表达ｃＤＮＡｓ。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物ＩＬ－２活性。经过３轮筛选,获得１４个具有ＩＬ－２活性的克隆。选择其中４个进行酶切分析,结果显示这４个ｃＤＮＡ大小分别为１．５,１．０,０．８和０．８ｋｂ。     

贵州白香猪脂蛋白酯酶基因cDNA的克隆与序列分析

随着生活水平的不断提高,人们对猪的肉质如口感、风味、外观都有相当高的要求。影响猪肉质的因素很多,其中遗传和营养因素对肉质有明显的作用。肌间脂肪与口感呈正相关,当猪的肌间脂肪含量达到2%～3%时,猪的肉质有较好的口感。动物组织脂肪的沉积能力主要受组织中脂肪合成与分解的影响,在很大程度上取决于甘油三酯和脂肪酸的转运速度。脂质代谢中,参与合成和分解代谢的脂质均须     

卡特兰ACC氧化酶cDNA片断的克隆与序列分析

以卡特兰(Cattleya)花朵为试材,首先提取总RNA,并根据其它兰花的ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO)基因保守序列设计1对特异性引物,然后通过RT-PCR法,克隆得到一条卡特兰ACC氧化酶的cDNA片断,该片断长度为967 bp,共编码321个氨基酸残基。序列分析结果显示该克隆片断与已发表的其它兰花的ACC氧化酶基因序列同源性很高,均在85%以上,尤其与其近亲C.bicolor、C.inter-media、Laelia anceps的同源性均在95%以上。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

猪NPY受体Y1 cDNA的克隆及分析

[目的]研究猪NPY-Y1受体在猪激素分泌及发育生理功能中的调节作用。[方法]从初情期的苏姜猪母猪中提取下丘脑组织总RNA,RT-PCR扩增出NPY-Y1 cDNA,扩增产物克隆入pGEM-T easy载体中进行序列测定。[结果]试验扩增产物与GeneBank公布的猪NPY-Y1序列比较,其同源性达到100%。[结论]为下一步研究猪NPY-Y1基因的生理功能和作用机理奠定了基础。     

三黄鸡MAVS基因克隆及生物信息学分析

[目的]掌握三黄鸡线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因的生物信息学,为MAVS基因诱导表达及禽类固有免疫相关机制研究打下基础.[方法]根据GenBank中已公布的原鸡MAVS基因序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR扩增三黄鸡MA VS基因,并应用相关生物软件进行序列分析及其蛋白结构预测.[结果]三黄鸡MAVS基因编码区(CDS)全长1926 bp,编码641个氨基酸,与GenBank中已发表的原鸡MAVS氨基酸序列(NP 001012911.1)比对,三黄鸡MAVS氨基酸序列在第440、488、506和606位存在4个氨基酸差异,分别为440A→T、488P→L、506I→L和606E→K.三黄鸡MA VS基因与原鸡的相似性最高,达99.0%;与日本鹌鹑的相似性次之,为91.0%;与斑马鱼的相似性最低,仅37.6%.三黄鸡MAVS蛋白分子质量为67.79ku,理论等电点(pI)为5.04,属于跨膜蛋白,无信号肽序列;其二级结构中折叠占0.5%,无规则卷曲占88.7%,螺旋占10.8%.[结论]三黄鸡MA VS基因序列表现出高度的保守性,可作为今后研究三黄鸡抗病毒机制的重要指标之一.     

松材线虫actin基因全长cDNA的克隆

借助电子克隆和RACE方法,克隆了松材线虫生长发育关键基因actin的全长cDNA序列(登陆号:EU100952)。该序列共1 296个碱基,有一个完整ORF,起始密码子在48位,终止密码子在1 176位,编码376个氨基酸。