DNA不同提取方法对养殖池塘底泥细菌多样性PCR-DGGE检测的影响

应用PCR-DGGE技术研究了养殖池塘底泥中细菌DNA 5种提取方法对细菌多样性检测的影响。结果显示:(1)DNA粗提液中腐殖酸与蛋白的纯度无正相关;(2)5种方法提取的DNA粗提液经过纯化后进行PCR均取得良好结果;(3)采用复合破壁方法提取养殖池塘底泥细菌DNA有利于显示细菌多样性;(4)DNA提取方法是影响池塘底泥细菌多样性PCR-DGGE结果的关键因素,与DNA的产量、纯度关系甚微;(5)5种方法相似性高达0.79,在对养殖池塘底泥细菌多样性进行粗略分析时均可使用;(6)本试验中,基于改进的Martin-Laurent法是用于养殖池塘底泥细菌多样性PCR-DGGE研究的较好的总DNA提取方法。     

PCR-DGGE技术中不同DNA提取方法综述

DNA提取是PCR-DGGE技术中首要而关键的一个步骤,不同的方法提取的DNA产量和纯度等方面有差异,会对后续步骤产生很大影响。综述了目前广泛使用的DNA提取方法,以期为研究者提供参考。     

不同时期刺参养殖池塘海水菌群结构分析

对辽宁省大连市瓦房店刺参养殖池塘海水菌群结构组成和变化情况进行分析,采集不同时期刺参养殖池塘海水,扩增细菌16S rDNA基因V3可变区序列,进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）,分析指纹图谱,并对主要条带进行切胶、回收和测序。结果表明,不同时期海水各样品的多样性指数在1.994 5~2.230 5之间,均匀度差异不大,样品的丰富度在42~48之间。不同时期海水中3月和9月的菌群结构最为相近（80%）,6月与其他各时期聚类距离最大。对39个主要条带的测序结果表明,12个条带与未培养细菌相近,1个条带与放线菌纲（Actinobacteridae）的菌株相似,另外26个条带相似菌株分别归类为黄杆菌纲（Flavobacteria）、α-变形菌纲（Alpha proteobacteria）、γ-变形菌纲（Gamma proteobacteria）。黄杆菌纲、α-变形菌纲和γ-变形菌纲在各时期海水中均有出现,其中黄杆菌纲优势度最高,占23.8%~50.0%。不同时期养殖池塘海水菌群的结构相对稳定,但具体菌种存在差异。     

基于PCR-DGGE技术的冷藏牡蛎鳃部菌群分析

应用PCR-DGGE技术研究4℃冷藏期间牡蛎鳃部菌群的动态变化及腐败菌群.直接从牡蛎鳃部中提取细菌总DNA,对细菌的16S rDNA的V3区进行PCR扩增,扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),分析DGGE微生物指纹图谱.DGGE指纹图谱结果表明,新鲜牡蛎鳃部菌群复杂,随冷藏期的变化菌条带变化明显;整个冷藏期间Lactococcus raffinolactis和Enterobacter sp.为牡蛎鳃部的优势菌,牡蛎冷藏后期腐败的主要菌群为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、Weissella confusa和Lactobacillus sakei.     

盐度对池塘养殖影响的研究进展

盐度是水产养殖的重要参数之一.近年来,随着池塘养殖业的快速发展,由盐度变化所引起的养殖问题备受关注.本文系统地总结了盐度变化对池塘养殖环境以及对养殖生物的影响,并基于此提出了未来需要关注的研究方向,以期为盐度对池塘养殖影响的研究提供参考.     

养殖池塘底泥水体中适用于TaqMan荧光定量PCR的 不同DNA提取方法

通过人工模拟即在养殖池塘底泥和水样中加入阳性组织处理样品,对人工模拟的底泥样品分别采用磁珠法、酚氯仿法以及吸附柱法进行核酸提取,结果发现底泥含量对磁珠法和吸附柱法病毒DNA提取效果影响较小,而对酚氯仿法病毒DNA提取效果影响较大,且底泥含量较少提取相对较好。3种病毒DNA提取方法中采用混样提取核酸的效果均好于用上清液提取的效果。吸附柱法和磁珠法对病毒DNA提取效果较接近且明显好于酚氯仿法。通过对不同浓度的PEG6000进行浓缩后提取核酸,结果发现原始水样中未检测到CyHV 2或其含量极低未达到检测限。PEG6000浓度为13%时,核酸浓缩提取效果最佳。本研究为实时监测养殖池塘中的底泥和水体中是否存在病毒提供了一种参考方法,从而更好地维护水产养殖环境的生态安全和促进我国水产养殖业健康可持续发展。     

池塘水产养殖对环境的影响

阐述了饲料投喂和化学药品使用对池塘养殖环境的影响,提出了防治对策。     

秋、冬季刺参养殖池塘菌群的多样性分析

以黄海和渤海代表性刺参养殖池塘秋、冬季海水和沉积物基因组DNA为模板,以细菌16S r DNA通用引物进行PCR扩增,构建16S r DNA文库并进行测序分析,研究了秋、冬季刺参养殖池塘菌群的多样性。结果表明:海水和沉积物中主要包括11个门类的细菌,即变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、绿弯菌门(Chloroflexi);黄海和渤海刺参养殖池塘海水和沉积物中优势类群均为变形菌(变形菌比例>48%);用Shannon指数及Simpson优势度指数分析细菌的多样性,黄、渤海刺参养殖池塘中,冬季沉积物细菌Simpson优势度指数均最低,分别为0.014 89和0.016 50,Shannon指数均最高,分别为6.312和5.695。研究表明,黄海和渤海刺参养殖池塘中,冬季沉积物细菌多样性均最高。     

秋、冬季刺参养殖池塘菌群的多样性分析

以黄海和渤海代表性刺参养殖池塘秋、冬季海水和沉积物基因组DNA为模板,以细菌16S r DNA通用引物进行PCR扩增,构建16S r DNA文库并进行测序分析,研究了秋、冬季刺参养殖池塘菌群的多样性。结果表明:海水和沉积物中主要包括11个门类的细菌,即变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、绿弯菌门(Chloroflexi);黄海和渤海刺参养殖池塘海水和沉积物中优势类群均为变形菌(变形菌比例48%);用Shannon指数及Simpson优势度指数分析细菌的多样性,黄、渤海刺参养殖池塘中,冬季沉积物细菌Simpson优势度指数均最低,分别为0.014 89和0.016 50,Shannon指数均最高,分别为6.312和5.695。研究表明,黄海和渤海刺参养殖池塘中,冬季沉积物细菌多样性均最高。     

池塘养殖鳜鱼的几种常见模式

一、池塘主养1.池塘条件:池塘应水源充足,排灌水方便。池底平整,底质淤泥厚度应小于15厘米。每口养殖池塘面积不宜过大,一般为0.33￣0.46公顷(5￣7亩),水深2米左右,并配备增氧机一台。2.鱼种放养:鱼种放养前要对池塘进行清整和消毒,消毒药物以生石灰为主,其消毒方法与常规鱼池塘操作相同。药性消失后,选择晴天上午进行放养。一般每667平方米(1亩)放养4厘米左右的苗种1000￣1200尾,或5￣8厘米的苗种600￣800尾。鳜鱼种下塘前用每立方米水加甲醛300毫升兑成的药液浸洗5分钟,或用3%￣5%的食盐溶液浸泡3￣5分钟。3.饵料鱼种类、培育与投喂方法:(…     

陈化烟叶中细菌基因组DNA的提取及其多样性分析

以陈化10个月的河南襄城NC89烟叶为材料提取烟叶中细菌的基因组总DNA,并通过PCR—变性梯度凝胶电泳技术(DGGE),研究烟叶中细菌的多样性。结果发现,烟叶中细菌基因组16SrDNA V3区的PCR—DGGE图谱至少存在25条可分辨条带,其中4条亮度较强,表明陈化烟叶中细菌区系组成较多,优势种群可能有4种。     

油松阔叶混交林不同层次优势植被根区土壤真菌的群落结构

采用真菌的28S rDNA的特异性引物对千山油松阔叶混交林中乔木层、灌木层和草本层优势植被根区土壤中提取的真菌总DNA进行PCR扩增,并通过DGGE技术对PCR产物进行分析,结果表明:乔木层针叶树(油松、红松)根区土壤真菌的多样性最低,草本层植被根区土壤真菌的多样性最高.乔木层阔叶树根区土壤真菌群落结构与灌木层相似,草本层与二者差异较大.     

不同驯化手段下多氯联苯降解菌群落结构差异分析

[目的]研究不同驯化手段下多氯联苯降解菌群落结构差异,为多氯联苯污染场址的生态修复提供借鉴.[方法]应用PCR-DGGE技术对8种驯化手段下的活性污泥进行分析.[结果]加入同一种PCB单品的体系中,生物群落的相似度相对较高;好氧体系之间的相似性较好氧与厌氧体系之间的相似性要高;在好氧条件下,高氯PCB体系较低氯PCB体系中生物相丰富;好氧体系较厌氧体系的生物相丰富;一些物种在好氧体系和厌氧体系中均存在.[结论]该研究有利于多氯联苯降解菌库的充实和完善.     

不同方法提取鳗鲡病原茵DNA模板的差异分析

利用吸光值、琼脂糖电泳及PCR差异扩增等指标,对酚一氯仿法、水煮法、碱裂解法3种方法制备的鳗鲡病原菌DNA模板进行了差异分析．结果表明：1）不同方法提取的病原菌模板DNA的浓度、纯度及分子质量大小存在差异,但以这3种方法提取的病原菌DNA为模板,均能成功扩增到细菌16SrD．NA和外膜蛋白的保守序列．其中,酚一氯仿提取的模板DNA浓度较低、纯度较高;水煮法和碱裂解法提取的模板DNA浓度较高、纯度较低．2）电泳显示,3种方法获得的模板DNA扩增出的16SrDNA保守序列条带均一,没有显著差异,但在外膜蛋白保守序列的扩增中却因菌种和模板提取方法的不同而存在差异．     

适用于竹林土壤PCR-DGGE分析用的微生物总DNA提取及纯化方法

为了获得完整、高纯度的竹林土壤微生物总DNA,采用改良的十二烷基硫酸钠-高盐抽提法对5种竹林土壤进行DNA提取,通过DNA凝胶回收试剂盒纯化粗提的DNA,利用细菌16 SrDNA基因的V3区引物对纯化的DNA进行了聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）验证。结果表明,该方法所需土壤样品少,抽提的DNA片段均在23kb以上,完整性好;采用DNA凝胶回收试剂盒纯化能够有效去除粗提DNA中大部分杂质,获得高质量的DNA;以此DNA为模板进行DGGE检测所反映的微生物信息量丰富。图3表1参15     

PCR-DGGE方法分析玉米及苜蓿青贮动态发酵体系中菌群多样性

[目的]探讨玉米青贮和苜蓿青贮动态发酵过程。[方法]以玉米和苜蓿为青贮原料,利用氯化苄方法对青贮中微生物基因组DNA进行提取,以P2f和P3r为引物扩增目的片段并利用PCR—DGGE方法对玉米青贮及苜蓿青贮进行动态发酵多样性研究。[结果]玉米青贮的pH值在发酵过程中维持在4．0～4．5,而苜蓿青贮则维持在5．5—6．0。PCR-DGGE分析显示2种物料青贮在0和1d、3和7d、20和60d相似性均很高,并且它们具有基本相似的谱带类型,其中条带1、3、13、14、17、21、22为所有样品共有,只是亮度上有差异。DGGE研究结果表明大多数序列代表乳酸菌（LAB）类细菌,并以Lactobacillus类最多;其次为Lactococcus和Weissella。[结论]该研究为青贮添加剂的制作奠定基础。     

微生物燃料电池阳极生物膜微生物群落的PCR-DGGE分析

以养殖废水沼气池沼泥为接种物,构建了乙二胺、三氯化铁改性阳极的无介体单室微生物燃料电池(MFC)体系,均成功实现了连续产电,同时对废水中的污染物也具有很好的去除效果。为了更好地研究微生物燃料电池阳极生物膜的微生物多样性,分别采集了两种MFC阳极生物膜样品,采用PCR-DGGE法研究了一个完整产电周期的启动期(S)、葡萄糖产电稳定期(RG)和养殖废水原水稳定期(RS)的MFC阳极生物膜的微生物群落变化。结果表明,不同时期MFC阳极生物膜的微生物多样性存在明显差异,S-RG、S-RS、RG-RS的微生物群落相似性分别为70.1%、42.0%和50.6%。两种不同阳极富集的生物膜微生物群落相似性仅为48%,这表明不同改性方法所得的阳极对微生物具有选择性作用。对DGGE条带测序和比对发现,不同时期阳极生物膜上优势微生物包括Trichococcus sp.、Thauera sp.、Azoarcus sp.、Azospirillum sp.、Zobellella sp.、Pseudomonas sp.、Aeromonas sp.、Thiobacillus sp.、Desulfovibrio sp.、Thiomonas sp.,其中Pseudomonas sp.、Aeromonas sp.和Desulfovibrio sp.与已报道的相关产电微生物具有较高的序列相似度,这些菌种可能是本MFC体系中的主要产电菌。