大口黑鲈杀鱼爱德华氏菌的分离鉴定及耐药性分析

2022年3月,广东珠三角地区养殖的大口黑鲈（Micropterus salmoides）发生了大规模暴发性死亡,特别是佛山市南海区,死亡率高达20%～50%。为明确大口黑鲈死亡原因,采集佛山市南海区沙头镇腹部膨大和内脏缺血、体长25～35 cm濒死病鱼42尾,进行组织病理分析、病原分离与鉴定、病原菌毒力和耐药性检测等,为该病的诊断和防控提供科学依据。结果显示,病鱼主要临床症状为严重腹水、肝脏和鳃缺血以及肝脏和肾脏肿大。病理切片显示。肝脏和肾脏均严重组织变性和细胞坏死。从肝脾肾组织中均分离出大量菌落形态一致的细菌,其中肝组织细菌丰度最高。生化鉴定和16S r RNA分子鉴定结果表明：细菌S1为杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）,在系统进化树中与杀鱼爱德华氏菌（MN203719.1）自然聚为一支。动物回归感染实验表明该菌为引起大口黑鲈死亡的致病菌,且毒力很强。药敏试验结果显示,该菌对氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素等药物敏感,对利福平、阿莫西林、四环素耐受。     

一株鳙源鲁氏耶尔森氏菌的分离鉴定及其感染的肠道病理损伤

为确定患病鳙鱼致病菌及筛选敏感药物,通过平皿划线法从患病鳙鱼血液及体表溃烂组织中分离到1株革兰氏阴性的短杆菌JL9510,该菌株在电镜下呈短杆状,在LB固体培养基上呈透明状菌落。VITEK^?MS全自动快速微生物质谱检测结果证明,该菌株为鲁氏耶尔森氏菌的置信度为99.9。通过16S rRNA及系统发育树构建分析,发现菌株JL9510与已知菌株JQ657818.1 Yersinia ruckeri聚为一支,确定其是一株鲁氏耶尔森菌。人工回归感染试验结果证明,该菌株为患病鳙鱼的致病菌。VITEK 2 Compact自动化细菌鉴定和药物敏感性分析系统结果显示,鲁氏耶尔森氏菌JL9510有较高的致病力,且对氟苯尼考敏感,对环丙沙星耐药。试验的抗生素表现出良好的治疗效果,为鲁氏耶尔森氏菌的防治奠定了基础。     

大口黑鲈致死性结节病病原的分离、鉴定及组织病理学观察

2018年4月四川邛崃地区某养殖场大口黑鲈感染致死性结节病,死亡率高达80%。为明确病因,通过常规微生物分离、鉴定,从患病鱼皮肤溃疡灶、鱼鳔腔积液和肝脏组织中分离到同一株优势菌,命名为HSY-NS02。经菌体形态观察、革兰氏染色和抗酸染色镜检、生理生化实验、16S rDNA序列扩增及系统发育分析和特异性PCR扩增,确定该菌为诺卡氏菌。进一步对健康大口黑鲈进行分离菌的人工感染实验以确定其致病性,结果显示,人工感染鱼出现与自然发病相似症状,且从人工感染鱼体中再次分离到相同菌。组织病理学观察显示,皮肤溃疡灶、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和鳃发生不同程度的慢性炎性肉芽肿病变,其中脾脏病变最为严重。对菌株HSY-NS02进行药物敏感性实验,结果显示,该菌对庆大霉素、新霉素和制霉菌素3种药物敏感,对其他18种药物耐受,呈多重耐药性。     

鲟源致病性鲁氏耶尔森菌的分离、鉴定及药敏研究

2017年,新疆阜康市某鲟鱼养殖场的西伯利亚鲟出现大批死亡,主要症状为生殖孔红肿外突,腹部有点状出血。自患病西伯利亚鲟肝脏、脾脏分离到一株优势菌株XB2,通过革兰氏染色、生理生化试验、药敏试验,并对其16S rRNA基因序列进行测定,用Mega 6.0对序列进行分析。生理生化试验结果显示,菌株XB2为革兰氏阴性短杆菌,单独或成对出现;产酸不产气,V-P反应呈阳性,能利用蔗糖、果糖、葡萄糖、明胶、枸橼酸;在含1%(m/V)氯化钠中能生长,高于3%(m/V)氯化钠中不生长;在4℃不生长,20～30℃均能生长,但在37℃不生长;不利用乳糖、水杨苷、纤维二糖、硫化氢、酒石酸、阿拉伯糖。进化树显示,菌株XB2与鲁氏耶尔森菌KJ812974同源性达99%。通过回感试验确定其半致死密度为2.37×104 cfu/mL。结合生理生化鉴定结果和16S rRNA基因序列分析结果,确定菌株XB2为鲁氏耶尔森菌。药敏结果显示,鲁氏耶尔森菌XB2对氟苯尼考、左氧氟沙星、哌拉西林、阿洛西林等9种药物敏感,对麦迪霉素、大观霉素、链霉素、氨苄西林等15种药物耐药。     

氟苯尼考对鲁氏耶尔森氏菌体外药效研究

本文研究了氟苯尼考对鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)体外药效学,测定了最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)、生长动力学曲线和杀菌动力学曲线和抗菌后效应(PAE)及四种培养因子对氟苯尼考体外抑制鲁氏菌活性的影响。结果表明:MIC、MBC和MBC/MIC分别为0.5μg.mL-1、1μg.mL-1和2;鲁氏菌在液体培养基中1h后进入对数生长,大约持续7h;在用药4～6 h达到最大药效。由杀菌曲线可知,氟苯尼考的杀菌功效具有浓度依赖性;在2 MIC、4 MIC和8 MIC时,PAE分别为3.71±0.11、4.54±0.27和5.52±0.23;氟苯尼考对鲁氏菌作用最适pH值为6～8,且二价阳离子(Mg2+)、血清含量及细菌数量小于108时对药效无显著影响。因此,保证药物浓度和作用时间,并配合最适培养条件,是氟苯尼考发挥最高药效的前提条件。     

氟苯尼考在感染鲁氏耶尔森氏菌的西伯利亚鲟体内的药效学

通过构建鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)感染西伯利亚鲟(Acipenser baeri)病理模型,设立阴性对照组(不攻菌不给药)及阳性对照组(攻菌不给药),比较研究了高(50 mg.kg-1)、中(20 mg.kg-1)、低(5 mg.kg-1)氟苯尼考剂量治疗组和氯霉素(10 mg.kg-1)对照组西伯利亚鲟体内的药效学。连续给药3天后,阴性对照组和阳性对照组累计死亡率分别为0%和50%,表明病理模型构建成功;而氟苯尼考低、中、高剂量组和治疗对照组累计死亡率分别为30%、0%、0%、10%。愈后各实验组鱼血液中均无细菌感染;除阴性对照组外,鱼肝、肾组织中均可分离到鲁氏菌,但不致鱼死亡。实验结果表明,氟苯尼考对感染鲁氏耶尔森氏菌的西伯利亚鲟有较好的治疗作用,药效优于氯霉素,可用于治疗鱼类细菌性疾病。     

一株湖北源大口黑鲈蛙病毒的分离鉴定

采用电子显微镜观察和细胞培养等技术, 从湖北黄陂某养殖场患病大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内发现并分离到一株蛙病毒。患病大口黑鲈的临床症状主要表现为体表出血、溃疡, 肝脏发白。将病鱼内脏组织匀浆超微滤液接种鳜脑细胞系(mandarin fish brain, MFB)细胞能产生典型细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), 病毒滴度达到 10^8.36±0.15 TCID₅₀/mL。细胞培养病毒的超薄切片电镜观察结果显示, 细胞质中存在大量直径约为 150 nm 左右的正六边形病毒粒子, 呈晶格排列。细胞培养病毒的人工感染大口黑鲈试验结果显示, 7 d 内试验鱼死亡率高达 100%, 其临床症状与自然发病鱼相似。采用大口黑鲈病毒(largemouth bass virus, LMBV)的特异性 PCR 检测方法对患病鲈组织样品和细胞培养病毒样品进行检测, 均能扩增出 241 bp 的单一目的条带。进一步根据 GenBank 中 LMBV 主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因序列设计特异性引物, 均能从上述样品中扩增出 1392 bp 的 MCP 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)全长。将 MCP 氨基酸全序列进行比对, 结果显示其与 Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型及大口黑鲈溃疡综合征病毒的 MCP 氨基酸序列同源性高达 100%。系统进化结果显示, 与感染鱼类的虹彩病毒科蛙病毒属病毒, 如鳜鱼蛙病毒、Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型和大口黑鲈溃疡综合征病毒等聚成一支。这些结果证明, 该分离株为虹彩病毒科蛙病毒属的成员, 暂命名为大口黑鲈蛙病毒(largemouth bass ranavirus, LMBRaV)湖北株 LMBRaV-HB001。病毒敏感细胞系筛选试验结果表明, 病毒 LMBRaV-HB001 感染鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)、草鱼性腺细胞(grass carp ovary, GCO)、大鲵肌肉细胞(giant salamander muscle, GSM)和鲫脑组织细胞(gibel carp brain, GiCB)均能产生典型 CPE, 病毒滴度可达 10^8.0 TCID₅₀/mL 以上。本研究首次在湖北省养殖大口黑鲈体内分离与鉴定了 LMBRaV 病毒, 建立了病毒的细胞培养方法, 为进一步研究该病毒的传播、诊断和防控技术提供了重要参考。     

鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF基因的分子克隆、生物信息学与免疫原性分析

为筛选潜在的保护性抗原基因研制鲁氏耶尔森氏菌（Yersinia ruckeri）基因工程疫苗,实验利用特异性引物扩增分离自斑点叉尾（Ictalurus punctatus）的Y.ruckeri外膜蛋白omp F基因并对其进行分子克隆,应用相关软件和程序对其核苷酸及氨基酸序列进行生物信息学分析,并进行了omp F蛋白的表达和免疫原性检测。结果显示,omp F基因全长1 095 bp（Gen Bank登录号KP159420）,包含一个编码364个氨基酸的完整开放阅读框,其氨基酸序列具有极高保守性,与Y.ruckeri外膜穿孔蛋白omp F（Gen Bank登录号ADK27779.1）亲缘关系最近,序列一致性为99.2%,进化树聚为一支;具有1个革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,存在1个信号肽和1个跨膜区,是一种跨膜蛋白;具有12个与免疫相关的抗原决定簇区域。SDS-PAGE分析发现该蛋白主要以包涵体形式表达在沉淀,经Western-bolt显示omp F蛋白具有较好的免疫原性。以上结果表明omp F基因可作为Y.ruckeri基因工程疫苗的候选抗原基因。 

     

锦鲤摩氏摩根氏菌的鉴定及致病性研究

从患病的锦鲤分离出菌株MMGN02 -J2, 经人工感染均可使健康锦鲤发病, 并从濒死的试验鱼中再次分离出相同的细菌。经ATBExpression细菌鉴定系统及常规细菌学鉴定为摩氏摩根氏菌 (Morganellamorganii)。药敏试验结果表明该菌株对氧氟沙星、阿米卡星、环丙沙星、氯霉素、壮观霉素、诺氟沙星和链霉素敏感。     

鰤诺卡氏菌灭活疫苗对大口黑鲈非特异性免疫指标的影响

研究大口黑鲈(Micropterus salmoides)对鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)灭活疫苗非特异性免疫应答的变化过程,为预防鰤诺卡氏菌病提供理论依据,可促进养殖业健康发展。大口黑鲈平均体长(10±2)cm、平均体重(30±2)g,鰤诺卡氏菌从患病大口黑鲈身上分离鉴定获得。600尾大口黑鲈随机分为免疫组和对照组,每组300尾,免疫组通过腹腔注射菌浓度为1.0×10⁹CFU/mL的鰤诺卡氏菌灭活疫苗0.5 mL/尾,对照组注射同等剂量的磷酸盐缓冲液。免疫后的第1、7、14、21、28和35天采集血液样品,测定血细胞数量、吞噬细胞吞噬活性、溶菌酶活力、酸性磷酸酶活力以及超氧化物歧化酶活力等非特异性指标。免疫接种第35天后进行攻毒试验,计算相对免疫保护率。结果表明：免疫组血细胞数量显著增加,红细胞和白细胞数量均于第7天达峰值,分别为(4.49±0.23)×10⁶个/mm³和(3.88±0.24)×10³个/mm³;免疫组吞噬指数和吞噬百分比均在第7天达到最高值...     

大口黑鲈北方亚种, 佛罗里达亚种及“优鲈3号”杂交F1子代生长性能及遗传多样性分析

文章以大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 佛山群体和台湾群体为亲本,建立了佛山自交、台湾自交、正交子代 (佛山♀×台湾♂)、反交子代 (台湾♀×佛山♂) 4个试验群体,通过6个月的养殖试验,对其生长和形态差异进行了比较。结果显示,正反交子代的生长性能和体质量变异系数均高于2个亲代自交群体。形态分析结果表明,4个试验群体的形态差异主要集中于躯干的中部和尾部。前三主成分累计贡献率达92.9%,第一主成分贡献率为71.3%,主要反映躯体前、中部形态特征;第二主成分贡献率为16.6%,主要反映躯体后部特征。前二主成分因子得分散点图中4个群体重叠区域较小,可以完全区分。将可量性状和框架性状结合在一起所构建的逐步判定模型推测准确率最高 (86.7%~96.0%)。研究结果可为大口黑鲈佛山群体、台湾群体及其杂交子代的生长与形态鉴定提供基础数据。     

饲料中高直链淀粉对大口黑鲈肠道物理屏障和菌群的影响

为了评价淀粉结构对大口黑鲈肠道健康的影响,用10%的普通玉米淀粉（直/支链比例为3：7,CS）和高直链玉米淀粉（直/支链比例为7：3,HACS）分别配制成CS和HACS两组等氮等脂的实验饲料,在室内循环系统中饲养初重为（8.53±0.06）g的大口黑鲈8周。结果显示,HACS组大口黑鲈特定生长率（SGR）和蛋白质效率（PER) 显著高于CS组。同CS组相比, HACS组肠道过氧化氢酶（CAT）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）的活性显著升高,且抗氧化基因nrf2、cat的表达量显著上调。同时,HACS组促炎细胞因子（tnf-α、il-8）的相对表达量显著下调,而抗炎细胞因子（tgf-β）的相对表达量显著上调。此外,HACS组在门水平中显著提高放线菌门的丰度,在属水平中显著提高有益菌乳酸菌属的丰度,降低部分潜在有害菌（不动杆菌属、考克氏菌属）的丰度。进一步表型预测发现相较于普通玉米淀粉,饲喂高直链玉米淀粉能显著降低革兰氏阴性菌比例,增加革兰氏阳性菌比例,显著降低潜在致病菌丰度。由此可见,高直链淀粉能提高大口黑鲈抗氧化能力和免疫水平,改善肠道形态结构和肠道菌群。因此,高直链淀粉能改善大口黑鲈的肠道健康状况。     

栅栏技术在淡腌半干鲈鱼加工工艺中的应用

为探讨活鱼宰前预冷对后期鱼片冷藏保鲜品质的影响,将鲜活大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 置于不同温度 (15 ℃、10 ℃、5 ℃) 的水槽中暂养0.5 h后,宰杀并取鱼片冰藏,分析第0、第3、第6、第9、第12、第15、第18和第21天时的鱼肉感官、理化指标 [ pH、挥发性盐基氮 (TVB-N)、鲜度指标 (K值)、硫代巴比妥酸 (TBA值) ] 及微生物 [菌落总数 (TVC) ] 变化情况,综合评价宰前预冷处理对大口黑鲈冰藏品质的影响。结果表明,15 ℃预冷处理可较好地保持大口黑鲈冰藏期间的品质,维持鱼肉感官品质,降低细菌的生长繁殖速度,延缓pH、TVB-N、K值、TBA值及菌落总数的上升,货架期较对照组延长约3 d。

     

罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究

从患暴发性流行病罗非鱼的肝脏中分离获得一株细菌TL60829NA,将TL60829NA对罗非鱼进行人工感染致病性试验,试验感染罗非鱼表现出自然发病症状,确认分离菌株为罗非鱼暴发性流行病的致病菌.分离株菌经形态学观察、Bio Merieux Vitek全自动微生物分析系统GPI测定卡分析和16S rRNA特异性基因序列与NCBI中收录的其它引起罗非鱼病害的链球菌的16S rDNA序列构建的系统发育进化树显示,分离细菌与其它无乳链球菌的16S rDNA序列构成一个进化分支,而海豚链球菌则构成另一分支,确定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalaciate).分离菌株对氨苄西林、青霉素G、卡那霉素等28种试验药物敏感,对妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星等15种试验药物不敏感.由无乳链球菌引起的罗非鱼暴发性流行病的主要病理变化为鳃小片结构崩解,鳃上皮增生、融合;心肌纤维变性、肌间白细胞浸润;肝脏颗粒变性和脂肪变性;肠道粘膜上皮变性、坏死、脱落、固有膜炎性白细胞浸润;肾脏组织大量嗜中性白细胞浸润,肾小管上皮细胞核固缩,小动脉血管壁玻璃样变性;眼睛的脉络膜和眶骨膜组织炎性坏死,晶状体纤维断裂和脱离.     

饲料中添加酶解鸡浆对大口黑鲈肝脏抗氧化能力、肠道物理屏障和肠道菌群的影响

为评价酶解鸡浆在大口黑鲈健康养殖方面的功效,本实验用3.5%的鱼溶浆(SW)和酶解鸡浆(EC)分别等量替代基础饲料中的鱼粉,配制成3种等脂(EE 11.3%)实验饲料,在室内循环系统饲喂初始体质量为(9.25±0.13) g的大口黑鲈8周。结果显示,各处理组大口黑鲈增重率(WGR)、特定生长率(SGR)和摄食率(FR)均无显著差异。EC组肝脏总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量以及抗炎细胞因子(TGF-β)和促炎细胞因子(IL-8)基因表达量均显著优于对照组(基础饲料)和SW组。同其他处理组相比,添加酶解鸡浆后,肠道紧密连接蛋白(occludin、zo-1和claudin-1)基因相对表达量显著上调,而血清中二胺氧化酶(DAO)活性、D-乳酸(D-Lac)和脂多糖(LPS)含量显著降低。同时观察到酶解鸡浆会影响大口黑鲈肠道菌群的丰度(OTUs和Chao1),在属水平上增加潜在益生菌芽孢杆菌丰度,降低部分潜在有害菌如志贺氏菌属、不动杆菌属、弧菌属和支原体的丰度。进一步表型预测发现,添加酶解鸡浆会显著降低革兰氏阴性菌比例,增加革兰氏阳性菌比例。研究表明,饲料中添加酶解鸡...     

美洲鳗鲡致病性鲍曼不动杆菌的分离、鉴定及致病性分析

为确定海南某鳗鲡养殖场患病美洲鳗鲡大量死亡的原因,从患病美洲鳗鲡肝脏和脾脏中分离获得1株优势菌株AB01,回归感染证实该菌株为导致此次美洲鳗鲡患病的病原菌。经生理生化鉴定、16S rDNA基因序列比对及系统发育分析,判定菌株AB01为鲍曼不动杆菌。致病性分析结果显示,菌株AB01对美洲鳗鲡的半致死浓度为4.63×106CFU/mL。组织病理学观察显示,患病美洲鳗鲡的肝脏、脾脏均发生不同程度的病变,其中,肝脏中部分肝索排列紊乱,细胞肿胀,胞核溶解,胞质疏松,结构模糊,有大量大小不等的空泡;脾脏中胞质多处稀疏,伴有大面积损伤。药敏检测显示,鲍曼不动杆菌AB01对头孢噻吩、头孢唑啉、阿奇霉素、丁胺卡那霉素、利福平、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星敏感,对氟苯尼考、氨苄西林等9种抗生素中度敏感,对氨曲南和四环素等20种抗生素有多重耐药性。     

大口黑鲈生长激素促分泌素cDNA结构和早期发育阶段表达谱分析

研究采用RT-PCR、RACE和PCR技术从大口黑鲈胃组织中克隆得到ghrelin基因的cDNA。该基因全长434bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)321bp,编码107个氨基酸的前肽,20个氨基酸的成熟肽位于第27位到第46位氨基酸处。前肽和成熟肽的氨基酸与已报导的舌齿鲈进行同源性分析,相似性分别为85%和90%。为进一步了解ghrelin基因在鱼体早期发育阶段的表达,本实验采用实时定量PCR(real-time PCR)方法检测了ghrelin基因在大口黑鲈胚胎和仔鱼发育过程的表达谱。结果显示,ghrelin基因在受精卵时期就有少量表达,但直到体节出现之前表达量均较低。出膜第4天ghrelin基因出现大量表达,第12天ghrelin基因表达量更显著增加,出膜第4天和第12天的表达量分别是受精卵时期表达量的206.77倍和531.20倍。出膜第4天正是大口黑鲈仔鱼开口觅食期,仔鱼消化系统初步发育成型,由完全利用卵黄囊营养转为从外界觅食阶段,到出膜第12天,仔鱼消化系统已发育完善,完全依靠外界营养提供能量,由ghrelin基因的表达量变化可推测其可能参与了鱼类早期发育阶段的摄...     

国产鸡肉粉替代鱼粉对大口黑鲈生长性能、肝脏健康及肠道屏障的影响

为评价鸡肉粉替代鱼粉的可行性,用不同水平国产鸡肉粉(PBM)等蛋白替代基础饲料中的鱼粉,配制成5种等氮等脂的实验饲料(对照组、PBM 12.5、PBM 25.0、PBM 37.5及PBM 50.0),在室内循环系统饲喂初始体重为(9.25±0.13) g的大口黑鲈8周。结果显示,各处理组大口黑鲈的增重率(WGR)、特定生长率(SGR)和摄食率(FR)均无显著差异。同对照组相比,实验组肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著增加,而丙二醛(MDA)含量显著降低。随鸡肉粉替代水平的增加,肝脏抗炎细胞因子基因(IL-10、TGF-β)相对表达量显著上调,而促炎细胞因子基因(IL-8、TNF-α)相对表达量显著下调,但肝脏的组织结构无显著临床症状变化。此外,随替代水平的增加,肠道抗氧化基因(sod、cat)和肠道紧密连接蛋白基因(Occludin、ZO-1和Claudin-1)相对表达量也显著上调,而血清D-乳酸(D-lac)和脂多糖(LPS)含量显著降低。研究表明,鸡肉粉替代基础饲料(基础饲料中含有40%的鱼粉) 50%的鱼粉不会抑制大口黑鲈的生长,同时还会增强鱼体的抗氧化...