初探母源免疫处理草鱼母本及其子代5种免疫因子含量的周年变化规律

为探究草鱼母源免疫因子传递特性,实验借助酶联免疫吸附实验(ELISA)和实时荧光定量PCR (qPCR)技术分别检测分析了草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)弱毒疫苗免疫草鱼母本及其子代(即母源免疫子代)早期胚胎阶段至1龄期间5种免疫因子(IgM、C3、LZM、MBL和Bf)蛋白活性和基因表达水平的周年变化规律。结果显示,草鱼母本经GCRV弱毒疫苗免疫后,血液中5种免疫因子蛋白活性及基因表达水平在产卵期均显著高于对照组1.5倍以上,至免疫后第11个月与对照组无显著差异。母源免疫子代发育至水花(4 d)时,IgM、C3、MBL和Bf的基因表达水平均高于对照组;发育至乌仔(15 d)时,IgM、C3和Bf的蛋白活性水平均略高于对照组;发育至5～11月龄时,5种免疫因子在肝脏、脾脏、肾脏和头肾等免疫器官中仍存在高表达。研究表明,GCRV弱毒疫苗促使母源免疫因子在亲本和子代体内富集表达具有一定的时效性,最长可维持至11个月,为实际生产中草鱼母本疫苗免疫程序的制定提供参考依据。     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型自然发病与人工注射感染草鱼的病理症状和病毒分布研究

为了探究自然发病和人工注射感染草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型(GCRV-Ⅱ型)草鱼的临床症状、病理特征和病毒分布的区别，实验采用临床剖检、组织病理学观察、分子生物学检测、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)等检测方法开展实验，通过对自然发病和人工注射感染草鱼的临床症状进行比较，结果显示，患病草鱼的眼眶、鳃盖、口腔、腹部、鳍条基部、肠道、肌肉出现明显的点状出血，且后者的出血情况比前者更为严重；比较组织病理切片，发现草鱼感染组织出现不同程度的充血和红细胞充盈现象，其中，人工注射感染草鱼的肠道、肌肉和肝胰脏的病变程度更为严重，呈现出较为严重的组织内出血和病变，而自然发病草鱼的鳃和脾脏的病变程度更为严重，鳃呈现出较为严重的充血和炎症增生物，脾脏出现大面积含铁血黄素沉积块病灶。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，GCRV在不同的组织中均有分布，头肾在两种感染方式的患病草鱼中的病毒量都比较高，人工注射感染草鱼的肝胰脏、肠道和肌肉的病毒量较高，自然发病草鱼的中肾、鳃和脾脏的病毒量较高。因此，在人工注射感染时，肝胰脏、肠道和肌肉可能是GCRV入侵的主要靶...     

IL-8在LPS诱导的草鱼炎症过程中的表达特征

采用原核表达获得草鱼白细胞介素-8(IL-8)重组蛋白,并以腹腔与皮下组织交替注射的方法免疫小鼠,制备抗草鱼IL-8的多克隆抗体。采用免疫印迹(Western blot)和酶联免疫吸附(ELISA)技术检测抗体的特异性与效价,运用流式细胞术分析健康草鱼及细菌脂多糖(LPS)刺激后草鱼各免疫相关组织中IL-8的表达特征。结果显示,草鱼IL-8多克隆抗体效价可达1∶40 000。健康草鱼的胸腺、头肾、肝脏、肠道、鳃、脾脏、体肾等组织均表达IL-8蛋白,其中,头肾和鳃中表达量较高。LPS刺激后,各组织IL-8蛋白表达量均显著升高,其中,肠道、肝脏、肾脏在LPS刺激4 h后IL-8蛋白上调达最高峰,头肾、脾脏、鳃于LPS刺激后12 h时表达量最高,胸腺则在24 h时达最高峰。研究表明,IL-8参与了草鱼炎症应答;IL-8表达量的升高,可作为早期炎症监测指标,应用于养殖鱼类炎症性疾病的预警指标。     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。     

VP35蛋白对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒增殖的影响

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用,实验扩增了S11基因并插入载体pCMV-3×flag中,构建pCMV-3×flag-S11真核表达质粒,转染草鱼肾细胞(CIK)后感染Ⅱ型GCRV,收集感染后的上清液与细胞。首先利用实时荧光定量PCR中相对定量的方法检测细胞样品中Ⅱ型GCRV-S6基因的mRNA。结果显示,过表达VP35在病毒mRNA水平促进Ⅱ型GCRV的增殖;然后扩增S6基因并插入到载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒,纯化Ⅱ型GCRV-VP4蛋白并制备多克隆抗体,用Western blot检测收集的细胞样品中的VP4蛋白,结果表明过表达VP35在病毒蛋白水平促进Ⅱ型GCRV的增殖;最后使用pET-32a-S6质粒作为阳性标准质粒并制作标准曲线,建立Ⅱ型GCRV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法,利用该方法检测细胞上清液中的病毒颗粒,结果表明过表达VP35增加Ⅱ型GCRV病毒拷贝数。本研究从3个维度证明过表达VP35蛋白促进Ⅱ型GCRV增殖,有助于深入解析VP35蛋白功能,也为进一步探究Ⅱ型GC...     

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。     

GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本的免疫因子代间传递与表达特性

为探究GCRV弱毒疫苗母源性免疫的草鱼母本及其子代免疫因子(IgM、C3、LSZ)表达特性及代间传递效应,采用ELISA、Rt-q PCR等方法检测了草鱼母本产前40 d接种疫苗后,母本血液、子代早期发育阶段及2月龄幼鱼3种免疫因子的蛋白活性及基因表达水平。结果显示,经GCRV弱毒疫苗免疫的草鱼母本血液、早期胚胎及幼鱼阶段IgM蛋白活性均显著高于对照组样品。子代各阶段中,28日龄的夏花样品IgM蛋白活性水平最高,而5日龄水花样品中蛋白活性最低;从受精卵发育至3日龄水花阶段,实验组样品免疫因子C3和LSZ的蛋白活性均显著高于对照组;2组鱼中IgM、C3和LSZ蛋白的活性水平随着发育进行,总体上呈先下降后升高的趋势,从卵细胞至3日龄水花阶段实验组样品C3和LSZ蛋白活性水平均显著高于对照组。实验组和对照组受精卵IgM基因的表达水平差异最大,实验组表达量为对照组的3.4倍。从24 h器官形成期至3日龄水花样品中,实验组C3基因的表达水平显著高于对照组。从卵细胞至3 h囊胚期阶段,实验组LSZ基因表达水平显著高于对照组。实验组2月龄草鱼体肾、头肾、脾脏组织中IgM基因表达量均显著高于对照组;感染GCRV病毒后,实验组死亡尾数(2尾)低于对照组死亡尾数(5尾)。研究表明母源性免疫可在草鱼进行代间传递,并对子代起到一定程度的免疫保护作用。     

草鱼HSP90基因cDNA序列克隆及其组织表达差异

根据斑马鱼HSP90(Heat shock protein)序列(NM_131328)设计并合成一对引物,提取草鱼肝脏组织总RNA,RT-PCR扩增获得草鱼HSP90基因cDNA部分序列596 bp,获得GenBank登陆号为FJ517554.将测序结果利用DNAman软件与其他几种已知序列的鱼进行比对,结果表明,草鱼HSP90与斑马鱼、鲤、鲋的同源性依次为90%、89%、92%.同时利用半定量(Semi-quantitative,SQ)RT-PCR技术检测HSP90在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达差异.结果表明,HSP90在草鱼除了鳍外的其他11个组织中均检测到表达,其中在心脏中表达最高,但与鳃、性腺、脑、脾脏中的表达无显著差异(P>0.05),在脂肪、粘液、鳔组织中的表达显著低于其他几种组织(P<0.05),在肝脏、肌肉与肠中的表达无显著差异(P>0.05).     

草鱼天然抗性相关巨噬蛋白基因全长cDNA的克隆与表达分析

天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)家族是一类抑制胞内寄生菌侵染的天然免疫相关蛋白.本研究克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Nramp基因并进行了表达分析.该基因cDNA序列全长为3158 bp,编码1个含544个氨基酸的蛋白.该蛋白含有Nramp家族的特征序列:包含12个跨膜区(TM)、1个由20个氨基酸残基组成的胞质内转运结构域(CTM).草鱼Nramp同其他16个物种的Nramp氨基酸序列同源性在62.5%～90.2%之间.草鱼Nramp基因cDNA的独特结构是其3味端非翻译区(UTR)和5'UTR各有1个脊椎动物Nramp2中的铁反应控制蛋白结合位点(IRE).系统进化分析表明,草鱼Nramp和所有鱼类Nramp聚为一簇,与哺乳类Nramp2的亲缘关系较近.Nramp基因在单鱼头肾和脾脏中的表达量最高,在肌肉和皮肤中的表达量最低,在草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染的草鱼肾脏细胞系(CIK)中的表达量明显升高.     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/O细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗VP4重组蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)的杂交瘤细胞,分别命名为2C2、2F3和5E5.抗体经亚型鉴定均为IgG1,轻链为K链;间接ELISA试验证明,3株杂交瘤细胞分泌的MAb可特异性识别GCRV-HZ08,与GSRV,ISKNV,IHNV均无交叉反应.选择2C2作为腹水生产细胞株,免疫小鼠后腹水ELISA效价为1∶720 000;IFA和Western-blotting结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的MAb能够特异性识别GCRV-HZ08病毒粒子.本实验制备的MAb具有良好的生物学特性,为GCRV流行株血清学检测方法的建立及VP4蛋白相关功能研究奠定了基础.     

盐酸小檗碱对草鱼补体系统及补体c3作用的研究

为了探究盐酸小檗碱(berberine hydrochloride)对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)补体c3的作用机理,用含0、0.06%、0.12%、0.24%盐酸小檗碱饲料投喂草鱼,在第7 d、14 d检测血清中补体c3含量,在第14 d检测肝脏中补体c3 mRNA表达量及急性感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后存活情况。并进一步对盐酸小檗碱体内药代动力学和补体消耗试验进行了研究。结果显示;摄食盐酸小檗碱的草鱼血清中补体c3含量和肝脏补体c3 mRNA表达量均显著性增加(P0.05/P0.05),草鱼的存活率与对照组相比也有显著性提高(P0.01)。补体消耗试验结果显示,当盐酸小檗碱在血清中浓度小于5 mg/L时与对照组相比补体消耗不显著,当盐酸小檗碱浓度大于5 mg/L时,补体消耗达到显著性差异(P0.05),表明此时盐酸小檗碱与补体c3直接结合,激活补体。药代动力学实验发现,灌服盐酸小檗碱后,出现双峰现象,两峰值分别是0.243 mg/L和0.117 mg/L,此浓度远远低于与补体c3直接结合量最低量(5 mg/L)。结果表明,盐酸小檗碱对草鱼补体c3的作用机理可能是通过上调补体c3mRNA的表达增加补体c3数量,而非通过直接结合补体c3来改变其活性。     

氯氰菊酯暴露对草鱼4种器官组织结构的影响

通过氯氰菊酯对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼(9.30±0.48)g的急性毒性实验及对鳃、肝、肾、脾的组织学研究,探讨了随着氯氰菊酯浓度的增加以及暴露时间的延长草鱼组织结构损伤的变化趋势.结果显示:氯氰菊酯对草鱼种的48 h-LC50和96 h-LC50分别为55.21μg/L和25.00...     

草鱼NADPH氧化酶2个调节亚基cDNA的克隆及表达特征

为了解草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NADPH多酶复合体的基因结构及其在机体的防御体系中的功能,利用RT-PCR结合RACE-PCR的方法,克隆草鱼NADPH氧化酶的2个调节亚基p40phox和p47phox的cDNA,对其编码的氨基酸序列进行了同源性比较和功能域分析,同时对这两个亚基在草鱼不同组织中的差异性表达进行分析。结果显示:p47phox亚基cDNA序列全长为1 589 bp,开放阅读框长度为1 233 bp,编码410个氨基酸;p40phox亚基cDNA序列全长为2 103 bp,开放阅读框为1 068 bp,编码355个氨基酸。这两个亚基编码的氨基酸序列与其他鱼类的同源性在68%~96%,具有其它鱼类类似的PX,SH3,PB1和PC功能域。组织差异性表达分析结果表明:2个调节亚基在草鱼胸腺、心脏、头肾、鳃、肠、肝、肾、脾和皮肤组织中均有表达,在不同组织中的表达强度略有差异,在心脏、胸腺中表达水平最高,在肝脏中表达水平较低,但是不同组织之间的表达水平差异不显著(P>0.05)。     

草鱼呼肠孤病毒GCRV VP56相互作用蛋白的鉴定

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白VP56与宿主蛋白的相互作用,实验采用酵母双杂交Gal4系统鉴定与VP56相互作用的草鱼蛋白。首先利用RT-PCR技术从Ⅱ型GCRV感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因VP56,构建p GBKT7-VP56诱饵表达载体;在酵母菌株中检测其自激活性后,以VP56为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株,并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼JAM-A(Gc JAM-A)基因,并构建p GADT7-Gc JAM-A载体,在酵母中研究草鱼Gc JAM-A与病毒蛋白VP56相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒p GBKT7-VP56无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选;从草鱼肾细胞文库中筛选得到9株阳性克隆,基因测序及序列分析确定其中包含草鱼7个细胞内蛋白和1个细胞外基质蛋白;VP56蛋白与Gc JAM-A蛋白在酵母中不能发生相互作用。本研究初步确定了与Ⅱ型GCRV蛋白VP56存在潜在相互作用的宿主蛋白,为深入探讨VP56蛋白在Ⅱ型GCRV感染宿主过程中的生物学功能奠定了基础。     

草鱼细胞蛋白酶亚基β7与草鱼呼肠孤病毒非结构蛋白NS12相互作用

为研究草鱼I型呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)非结构蛋白NS12的功能,实验利用酵母双杂交实验、GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)和对GCRV感染过表达宿主蛋白酶体亚基β7(proteasome subunit beta type 7, PSMB7)的草鱼卵巢细胞(grass carp ovarian cell,GCO)中ns12转录水平的表达量进行实时荧光定量PCR检测,研究PSMB7和NS12的相互作用。酵母双杂交实验结果表明,PSMB7与GCRV编码的膜相关的非结构蛋白NS12也存在着潜在相互作用。GST-pull-down检测结果证实PSMB7与GCRV编码的膜相关的非结构蛋白NS12存在相互作用;PSMB7过表达能够上调ns12在病毒感染过程中的转录水平表达量;免疫印迹验证NS12对于蛋白降解并不敏感。本实验室先前研究证实PSMB7在病毒感染过程中表达恒定。综上所述,这些结果揭示GCRV NS12与PSMB7存在分子间相互作用,但并没有作为PSMB7的底物。表明其可能竞争性地阻碍蛋白酶体复合物的形成。病毒蛋白干扰蛋白酶体复合物胞内PSMB7的积累可能是其一种针对蛋白酶体介导的先天免疫的免疫逃逸策略。     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究

根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。