三株AHPND致病型副溶血性弧菌烈性噬菌体的分离鉴定及其生物学特性

为分离获得AHPND致病型副溶血性弧菌烈性噬菌体,并鉴定及研究其生物学特性,本研究以AHPND致病型副溶血性弧菌为宿主菌,采用双层平板法分别从中国福建及墨西哥海水样本中对其噬菌体进行分离;通过噬菌斑形态、限制性内切酶、全基因组测序构建系统发育树及透射电镜观察对所获噬菌体进行分类鉴定;同时对供试噬菌体裂解谱及其生物学特性进行测定,包括最佳感染复数(MOI)、pH稳定性、热稳定性、过氧乙酸稳定性及不同储存温度下的存活稳定性等。结果显示,本研究分离获得3株AHPND致病型副溶血性弧菌烈性噬菌体P46、P48及VP7,3株噬菌体的噬菌斑均呈透亮圆形,P46噬菌斑直径4～5 mm,P48与VP7噬菌斑直径5～6 mm。3株噬菌体核酸均为双链DNA,电镜下观察其头部均呈二十面立体结构,直径约60 nm,尾部宽约8 nm,长约18～20 nm,属于短尾噬菌体科。3株供试噬菌体对AHPND型副溶血性弧菌裂解率达91.5%,对非AHPND型副溶血性弧菌裂解率为92.3%,且无法识别除副溶血性弧菌外其他种属的细菌;噬菌体P46、P48及VP7感染AHPND致病型副溶血性弧菌的最佳MOI分别为0.001、0.1及0.001;P46与VP7最适pH为6～8,P48最适pH为6～9;3株噬菌体对60°C的温度耐受力较强,在4°C条件下存放50周后仍具有较高的存活率;对通用杀菌浓度的过氧乙酸具有一定耐受性。将噬菌体P46、P48及VP7保守蛋白序列在NCBI数据库中比对后发现,3株供试噬菌体与其他噬菌体同源性较低,因此,噬菌体P48与P46及VP7很可能为3株新发现的短尾科噬菌体,这是中国首次报道AHPND致病型副溶血性弧菌短尾科噬菌体。本研究丰富了AHPND致病型副溶血性弧菌噬菌体的菌种资源,并为其应用于噬菌体生物防治制剂的开发奠定了理论基础。     

溶藻细菌的分离及溶藻特性研究

从爆发蓝藻水华的鱼池采集水样,以铜绿微囊藻为对象进行溶藻细菌筛选,得到R1、R2、R3、R5、R6、R8和R9共7株溶藻细菌,生理生化特征初步鉴定R5为海鱼弧菌,另6株为非发酵型细菌.R1、R3、R5、R8和R9细菌含量为105～108 cfu/ml时,对微囊藻的抑制率很高,效果优于R2和R6.对R1、R3、R5和R9...     

cbpD基因对溶藻弧菌毒力及相关生物学特性的影响

为研究几丁质结合蛋白(Chitin-binding protein D,CbpD)对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力和相关生物学特性的影响,通过同源重组技术构建溶藻弧菌ZJ-T的cbpD基因缺失突变株ZJ-T-ΔcbpD,比较突变株与野生株对斑马鱼(Danio rerio)的毒性,以及毒力相关生理过程,包括生长能力、运动性、胞外蛋白酶分泌活性、溶血活性、抗生素敏感性、生物膜形成、过氧化氢(H₂O₂)和铜离子(Cu²⁺)抗性以及铁离子(Fe³⁺)吸收能力的差异。研究发现,cbpD缺失后,溶藻弧菌对斑马鱼的毒力显著减弱,且细菌游动能力、涌动能力和胞外蛋白酶活性均降低,突变株对Cu²⁺的抗性提高;cbpD的突变不影响溶藻弧菌在富营养培养基中的生长、生物膜的形成、溶血活性、对大部分抗生素敏感性、对H₂O₂的抗性和Fe³⁺的获取能力。结果表明,cbpD可能通过正调控溶藻弧菌的运动能力和胞外蛋白酶分泌...     

一株副溶血弧菌噬菌体的分离与鉴定

分离到2株副溶血弧菌噬菌体,筛选出其中具有强裂解性的1株.该噬菌体的噬菌斑中心清亮,边缘有晕环.12 h观察,噬菌斑直径约3 mm,效价为1011pfu/ml.该噬菌体的核酸为线型双链DNA,大小约4 kb.电镜观察显示,头部为正二十面体,直径约110 nm,有尾,尾长约270 nm,底部有3个刺突.按国际病毒分类委员会第五次报告的分类标准,该噬菌体具肌尾噬菌体科的特征,与其他副溶血弧菌噬菌体比较显示,该噬菌体可能是一种新型的副溶血弧菌噬菌体.     

溶藻弧菌相关分离株的分子及VITEK鉴定

哈维群弧菌是弧菌属的核心菌群,包括溶藻弧菌在内的6个种在表型和遗传型上均十分相似,要准确鉴定各种有一定难度。看家基因的研究及生化鉴定系统的出现为弧菌鉴定提供了多种方法,本文比较了16S rRNA基因、toxR基因和pyrH基因以及VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对溶藻弧菌相关分离株的分辨力。哈维群弧菌基因组内16S rRNA基因是多拷贝的,且拷贝间序列差异大于种间差异,不适用于种的鉴定。单拷贝基因toxR和pyrH序列种内差异均小于种间差异。基于toxR基因相似性比较可清楚地将18个疑似溶藻弧菌分离株和5个参比株归并到4个种;toxR基因系统发育学分析也显示,哈维群弧菌各种独立地聚类分支,且溶藻弧菌种内存在两个明显的聚类分支,说明两个分支的溶藻弧菌具有独立的进化方向。pyrH基因的相似性比较和发育学分析也得到类似的结果,但pyrH基因具有较强的保守性,因而分辨力稍低于toxR基因。VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡在鉴定溶藻弧菌时也有一定的错误率,且鉴定谱较窄。因此,建议在实际应用中采用toxR基因比对作为溶藻弧菌快速鉴定的主要手段,可再选用pyrH基因对鉴定结果进行验证。     

VP10—一株海洋噬菌体的分离及特性研究

以河流弧菌-Ⅱ(Vibrio fluvialis-Ⅱ)为指示菌,从大连沿海水域中分离到了一株海洋噬菌体-VP10.电镜分析表明,VP10具有典型的廿面体头部及带尾鞘的尾部,为蝌蚪形噬菌体.此外,还进行VP10的热稳定性、pH稳定性及紫外照射稳定性等生物学特征的初步研究.     

创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究

对用Sarkosyl法分离的创伤孤菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌的外膜蛋白进行了初步的比较分析.这4种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotting的图谱有相似性亦有差异.SDS-PAGE显示,4种弧菌中除副溶血弧菌外均能分离到47、38 ku的外膜蛋白;创伤弧菌和溶藻弧菌存在4种共同的外膜蛋白,大...     

一株沙门氏菌烈性噬菌体的分离纯化与生理特性研究

自水产品市场的污水中采用双层平板法分离纯化出一株烈性沙门氏菌噬菌体S P3。利用电镜观察其形态特征,SDS-PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳分析其结构蛋白和核酸成分,并测定其生理特性。包括一步生长曲线、热和p H稳定性、抑菌活性和最适保存条件。结果显示该烈性噬菌体S P3为双链DNA ,属于长尾噬菌体科,结构蛋白为43．0～66．2 ku。该株噬菌体潜伏期5 min ,裂解期为75 min ,最适培养温度和p H分别为30～40℃和7～9,在液体环境中能够高效抑制沙门氏菌的生长。不同的保存方法显示,S P3在-20℃低温保存条件下活性保持较好。     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaB基因的克隆及原核表达

参照GenBank上登录的弧菌鞭毛蛋白flaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaB全长基因,序列分析结果显示该基因为1134bp,编码377个氨基酸。与GenBank中其它弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaB基因与副溶血弧菌flaB基因的同源性最高(92%)。将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出带His-tag的融合蛋白,分子量大小与预期一致。优化的表达条件为28℃,0.4mmol/LIPTG浓度诱导10h。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,制备了多克隆抗体。Western-blotting结果表明鼠抗FlaB血清不仅能与诱导后的重组蛋白发生反应,而且能与天然的溶藻弧菌全菌蛋白发生反应,提示鞭毛蛋白FlaB可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一,为下一步进行FlaB蛋白免疫原性的研究以及疫苗的制备奠定了基础。     

感染溶藻弧菌对日本蟳肝胰腺免疫功能的影响

摘 要：为探讨日本蟳感染溶藻弧菌的致病机理,采用溶藻弧菌人工感染健康日本蟳,分析了感染前后日本蟳肝胰腺 PO、SOD和LSZ活性变化及注射免疫多糖后的免疫保护率,并研究了细胞超微结构的病理组织学。结果表明：日本蟳感染溶藻弧菌后,肝胰腺中PO、SOD和 LSZ的活性均受到不同程度的影响,感染6~12 h,3种酶的活性均有一个上升的过程,但之后随时间的延长呈现下降趋势;免疫感染组因感染弧菌前注射了免疫多糖,日本蟳肝胰腺中PO、SOD和LSZ酶活性均显著高于感染组的酶活性,感染7 d后的免疫保护率高达72.73％,表明免疫多糖可提高酶的活性,使机体的抗病菌能力增强。超微结构显示：对照组日本蟳肝胰腺细胞结构形态正常,上皮细胞表面的微绒毛排列整齐,各细胞器结构完整;免疫组内质网、糖原颗粒和线粒体丰富,微绒毛排列致密;感染组肝胰腺组织受到明显的损伤,细胞和部分微绒毛脱落、受损;线粒体和粗面内质网变形、水肿或仅剩一空泡;核高度异染色质化,核膜破裂。与感染组相比,免疫后感染组具有形态结构较正常的细胞核、整齐致密的微绒毛和丰富的溶酶体,但依然可见水肿的内质网和狭长畸变的线粒体。     

黑褐新糠虾血细胞形态及其与日本新糠虾对溶藻弧菌敏感性的比较

实验采用Giemsa与Wright' s两种染色方法对黑褐新糠虾血细胞进行染色,根据血细胞大小,所含颗粒与否,颗粒多少和核质比将其分型,并对各型血细胞所占比例进行统计.结果表明,通过比较Giemsa染色与Wright's染色两种方法的染色时间和效果,Wright's染色更加适合糠虾血细胞.通过染色,将黑褐新糠虾血细胞分为3种类型,它们分别为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞.它们的胞体大小依次增大,核质比依次降低.对此3种类型血细胞比例分别统计后发现,颗粒细胞所占比例最多约( 48.38％±0.05％),其次是半颗粒细胞约为(35.22％±0.04％),最少的为透明细胞约为(16.40％±0.01％).对不同浓度溶藻弧菌的感染试验发现,日本新糠虾在较短的时间内出现死亡,即48h,而黑褐新糠虾72 h出现死亡,各浓度组中日本新糠虾死亡率均高于黑褐新糠虾.黑褐新糠虾相对日本新糠虾来说,对溶藻弧菌具有较低的敏感性,可能与其血细胞中颗粒和半颗粒比例较高有关.     

Effect of water temperature on the immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei to Vibrio alginolyticus

White shrimp Litopenaeus vannamei held in 25‰ seawater at 27 °C or 28 °C were injected with TSB-grown Vibrio alginolyticus at 1 × 10⁴ colony-forming units (cfu) shrimp^− 1 or 1 × 10⁵ cfu shrimp^− 1, and then cultivated onward at water temperatures varying from 20 to 34 °C. Over 24–144 h, mortality of V. alginolyticus-injected shrimp held at 34 °C or 32 °C was significantly higher than that of shrimp held at lower temperatures. In a separate experiment, shrimp held in 25‰ seawater at 28 °C and then cultured onward at 20 to 32 °C were examined for immune parameters at 24–96 h. THC, phenoloxidase activity, respiratory burst, and SOD activity decreased significantly at 24 h after transfer to 32 °C. Shrimp held in 25‰ seawater at 27 °C and then cultured onward at 20 to 34 °C showed a significant reduction in phagocytic activity and clearance efficiency for V. alginolyticus at 24 h after transfer to 34 °C. It was concluded that transfer of shrimp from 27 or 28 °C to higher temperatures (32 and 34 °C) reduced their immune capability and decreased resistance to V. alginolyticus infection.     

凡纳滨对虾中发光坎氏弧菌的分离、鉴定及致病性

为研究凡纳滨对虾死亡的致病机理,实验采用TCBS培养基从濒死凡纳滨对虾肝胰腺分离到浅绿色、直径3～7 mm的发荧光菌落;革兰氏染色为阴性短杆菌;经API 20E鉴定,分离株PvL-1与坎氏弧菌参考菌株CAIM249相似度为90％;fitZ序列与坎氏弧菌CP020076相似度为99.31％;gapA序列与坎氏弧菌EF59...     

溶藻弧菌外膜蛋白(Va-OMP)的免疫原性及免疫保护性

利用初步制备的溶藻弧菌外膜蛋白（outer membrane protein of Vibrio alginolyticus, Va-OMP）、溶藻弧菌蛋白分子量58 kD外膜蛋白（Va-OMP58）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus, Va）灭活菌苗、溶藻弧菌脂多糖（lipopolysaccharides of Vibrio alginolyticus, Va-LPS）菌苗等进行主动保护性和被动保护性的实验比较,VaOMP、Va-OMP58免疫组小鼠免疫后用活菌攻击,免疫保护率为62.5%～86.7%,而Va-LPS组和Va灭活菌苗组的免疫保护率为50%～62.5%,对照组的免疫保护率仅为6.7%。用不同抗血清免疫小鼠,活菌攻击后,Va-OMP组存活率达到53.3%和66.7%,VaOMP58组次之,存活率为40%和50%,Va灭活菌组的存活率为33.3%和46.7%,对照组为13.3%。与对照组相比较,Va-OMP组差异较显著,保护效果较好。溶藻弧菌外膜蛋白和蛋白分子量58 kD外膜蛋白的保护性效果高于溶藻弧菌灭活菌苗和溶藻弧菌脂多糖的保护性效果,证明外膜蛋白（outer membrane protein, OMP）具有较强的免疫原性。迟发性超敏反应试验也证明,OMP能诱发变态反应,间接证明OMP具有较强的引起细胞介导免疫反应的能力。因此实验证明,Va-OMP、Va-OMP⁵⁸是能在小鼠产生体液免疫和细胞介导免疫的保护性抗原。     

转座子mini-Tn10介导的运动突变对溶藻弧菌毒力的影响

采用转座子mini-Tn10/Km构建了致病性溶藻弧菌的突变库,采用半固体双层平板初筛到73株运动缺陷突变株,初筛的突变株纯化及重复筛选后获得运动性缺陷表型稳定的突变株ND-01MM,Southern鉴定确定其为单位点插入。野生型菌株ND-01和运动缺陷突变株ND-01MM对致病性溶藻弧菌的天然宿主大黄鱼粘液的趋化、粘附以及在大黄鱼吞噬细胞内存活能力等生理功能的比较研究发现,溶藻弧菌运动缺陷后趋化及粘附能力均极显著下降(P<0.01),但在吞噬细胞内的存活能力则与野生型菌株差异不显著(P>0.05)。采用腹腔注射和浸泡两种方式感染大黄鱼,结果发现运动缺陷对浸泡感染的影响较为明显,但对腹腔注射的感染方式影响不大。     

溶藻弧菌溶血素基因反向PCR克隆及其原核表达

溶藻弧菌的胞外产物(ECP)在其致病过程中发挥重要作用,已经观察到溶藻弧菌ECP所致的溶血现象,关于溶藻弧菌溶血素的种类和其对溶藻弧菌的致病性贡献的报道非常稀少。本文利用已经报道的多种弧菌溶血素基因序列设计通用引物,检测溶血素基因在溶藻弧菌中的分布,发现96个菌株中有74株扩增出溶血素基因(vah)片段。对致病株ZJ0451的 vah片段测序。根据已测得的片段序列设计引物,通过反向PCR扩增及后续克隆测序获得全长vah基因及部分侧翼序列。经比对证实溶藻弧菌vah与多种弧菌的TLH类溶血素高度相似,且其肽链N端有信号肽。利用pET32a载体构建了两种包含不同长度融合标签的vah表达载体,并均在大肠杆菌BL21(DE3)中获得可溶性表达。在26℃的诱导温度下,9h时vah表达量达到相对最大。在原核表达系统中,vah蛋白信号肽可以被切除。     

溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护研究

为研究溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护作用,实验构建了重组真核表达质粒pcDNA-flaC并将该质粒肌肉注射红笛鲷,采用PCR、RT-PCR、ELISA和攻毒试验等方法检测了该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达和对红笛鲷的免疫保护.PCR结果显示,免疫接种7和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7天、14天和28天,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达.ELISA结果表明,鱼血清内产生了抗FlaC蛋白的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体.攻毒实验表明,免疫后的红笛鲷能较好地抵抗致病性溶藻弧菌的感染.结果表明,质粒pcDNA-flaC可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的疫苗候选物.