溶血性曼氏杆菌PCR检测试剂盒的研制及初步应用

在溶血性曼氏杆菌PCR检测方法研究的基础上,进行溶血性曼氏杆菌PCR检测试剂盒的研究及初步应用.结果表明,试剂盒特异性好,批内和批间的试剂盒无差异;试剂盒在-20℃可保存30个月,4℃可保存12个月;应用试剂盒从1000多份临床样品中筛选分离到6株溶血性曼氏杆菌.     

绵羊肺炎支原体和溶血性曼氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测绵羊肺炎支原体(MO)和溶血性曼氏杆菌(Mh)的方法,本研究根据MO的hsp70基因和Mh的gcp基因分别设计引物,建立了同时检测这两种病原的双重PCR检测方法.实验结果显示该方法能够特异性的扩增MO (135 bp)和Mh (227 bp) DNA片段,其最低检出量分别为2.06×103拷贝/μL和6.37 c fu/mL,与单一PCR相同.该方法对常见的致病菌无交叉反应.对临床样本的检测结果显示MO和Mh的检出率分别为56.25％和52.50％,与单独PCR符合率为100％.研究结果表明,本研究所建立的双重PCR检测方法具有特异性强、敏感性高等特点,为临床上MO和Mh混合感染的快速检测、鉴定以及流行病学调查提供了方便、快捷、准确的方法.     

溶血性曼氏杆菌致病机制的研究进展

曼氏杆菌病是牛、羊等反刍动物的重要呼吸道传染病,给养牛和养羊业带来较大的经济损失,溶血性曼氏杆菌是该病的病原,作者对其生物学特性、临床症状、毒力因子、致病机制等进行简要概述,为进一步深入研究提供参考。     

牛源多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌双重PCR检测方法的建立与应用

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)是栖息于牛呼吸道的2种常见细菌,可引发牛的呼吸道疾病,对养殖业产生一定经济损失。为提高这2种细菌所导致疾病的临床诊断效率,本研究根据Pm的Kmt1基因、Mh的Lkt基因序列分别设计了特异性引物,建立了一种同时检测2种细菌的双重PCR检测方法。结果显示,建立的双重PCR方法对其他牛源细菌及病毒检测结果均为阴性,Pm、Mh病原基因组DNA的检测下限分别为1.57×10⁵,1.98×10⁶ copies/μL,表明该方法具有较好的特异性和敏感性。应用此双重PCR方法对宁夏地区118份临床样品进行了检测,结果显示Pm的检出率为57.63%(68/118),Mh的检出率为30.51%(36/118),混合感染检出率为24.58%(29/118),而且双重PCR检测结果与单一PCR检测结果一致,表明该方法可用于临床检测。Pm和Mh 2种病原双重PCR检测方法的建立,为牛呼吸道疾病的临床诊断提供了一种方便、快捷和准确的检测...     

云南羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

采用PCR鉴定、16S rDNA基因鉴定方法,对从云南某羊场病羊肺脏中分离到的1株革兰氏阴性小球杆菌进行系统鉴定,并对分离株的致病性和药物敏感性进行研究。鉴定结果表明:分离株溶血性曼氏杆菌PCR鉴定为阳性;分离株16S rDNA基因序列与GenBank上公布的其它溶血性曼氏杆菌同源性为96%~99%,与溶血性曼氏杆菌D171参考株同源性高达99%,因此将分离株系统鉴定为溶血性曼氏杆菌。致病性实验表明:分离株对小白鼠有致病性,该分离株对头孢呋辛、头孢曲松等头孢类抗生素和四环素最为敏感。本研究为我国南方省份曼氏杆菌病的防控和深入研究奠定了基础。     

2株山羊溶血性曼氏杆菌鉴定与分型

为了研究感染羊引起肺炎的溶血性曼氏杆菌的分子特征,分别从2只山羊肺部分离细菌,在血琼脂平板上分离纯化后,经培养、革兰染色镜检、生化试验、16S rDNA序列鉴定,结合临床症状鉴定这2株细菌为溶血性曼氏杆菌,分别命名为NH1、NH2。采用PCR方法,对2株溶血性曼氏杆菌进行血清型1型、2型和6型的鉴定,结果2株细菌均为血清型2型。采用多位点序列分型法对2株溶血性曼氏杆菌的7个管家基因扩增并测序,结果等位基因adk、aroE、deoD、gapDH、gnd、mdh和zwf的序号分别为1、1、3、1、1、1和4, 2株分离菌序列型一致,均是ST46。通过纸片扩散试验检测细菌对抗菌药物的敏感性,MH1对链霉素耐药,对多西环素和妥布霉素中介,对其他13种药物均敏感;MH2对链霉素中介,对其他15种药物均敏感。     

羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

对陕西省关中某奶山羊养殖场呼吸道症状引发死亡的羔羊进行病原检测.无菌采集死亡羔羊肺脏组织接种50 mL/L绵羊血琼脂平板,分别置于恒温培养箱与厌氧培养箱中36℃±1℃培养24 h,厌氧培养平板无菌生长,恒温培养血平板上可见大量溶血的灰白色、半透明的圆形菌落,挑取单菌落纯化培养后对分离株进行染色镜检、生化鉴定、16S r...     

绵羊肺脏中溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及其药物敏感性分析

为了对引起绵羊肺炎的病原进行分离、鉴定和耐药性分析,本研究通过无菌采集绵羊肺脏并对细菌进行分离纯化、生化试验和PCR鉴定,然后对所得到的溶血性曼氏杆菌分离株进行药物敏感性研究。结果显示,分离纯化得到的细菌为革兰氏阴性短杆菌,具有弱溶血性,经生化试验和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌;耐药性分析显示该菌株对恩诺沙星、庆大霉素、四环素等大部分药物敏感。本研究为绵羊溶血性曼氏杆菌感染的有效防制提供有用的信息和数据。     

溶血性曼氏杆菌PlpE基因原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立一种能够方便、高效检测溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)的方法,试验将溶血性曼氏杆菌重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,然后经IPTG诱导表达并纯化。以重组蛋白PlpE为包被抗原,通过优化抗原最佳包被浓度、一抗及二抗最佳稀释度、最佳反应时间和最佳显色时间等试验条件,建立了检测PlpE抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组质粒pET-32a-PlpE转化至感受态细胞BL21(DE3)后利用IPTG诱导,重组蛋白主要在沉淀中大量表达,经包涵体纯化试剂盒纯化后获得纯度较高的目的蛋白。重组蛋白PlpE具有良好的反应性,且蛋白大小符合预期。确定的检测条件为抗原包被浓度2μg/mL,一抗稀释度1∶300,酶标二抗稀释度1∶80 000,反应时间45 min,一抗反应时间30 min,显色时间15 min。用该方法检出溶血性曼氏杆菌阳性血清的最低效价可达1∶1 280,检测牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清、副结核分枝杆菌阳性血清、布鲁氏杆菌阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性...     

Mannheimia granulomatis PCR检测方法的建立

Mannheimia granulomatis是导致牛、羊呼吸道传染病的一种病原菌.为快速、准确诊断由该菌导致的疫病,从基因库中获得M.granulomdtis的基因序列,再从M.granulomatis的基因序列中获得与其他细菌包括溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌等不同的基因片段,设计引物,建立了特异性好、敏感性较高的M.granulomatis的PCR诊断方法.结果表明,其特异性为100%,最小检出量为5×104cfu/mL～5×103cfu/mL M.granulomatis或1/10个单个菌落.     

致肉牛运输热溶血曼氏杆菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

为探明一起肉牛运输热的病原及生物学特性,本研究无菌采集病死牛心血、肺脏、肝脏和脾脏,对其进行细菌分离、生化试验和PCR鉴定,并对分离株进行毒力基因检测、致病性研究。结果显示,7株分离菌均为革兰氏阴性短杆菌,具有微弱的β-溶血,瑞氏染色可见两极浓染及明显的荚膜。生化试验结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、木糖等碳水化合物,不发酵脲酶、MR-VP和吲哚,产生少量酸而不产气,结果符合溶血曼氏杆菌生化特性。PCR鉴定均为荚膜血清A2型,分离菌均含有四型菌毛相关基因ptfA、参与复制相关基因dnaN、白细胞介素相关基因LktC3种毒力基因。分离菌对小鼠的LD50值在107.83～108.50 CFU/mL之间,不同菌株间小鼠LD50值存在一定差异,但差异不明显。结果表明,引起该批肉牛运输热的病原为携带毒力基因的荚膜血清A2型溶血曼氏杆菌,本研究结果为进一步研究溶血曼氏杆菌的致病机制提供参考。     

Characterisation of a novel Mannheimia sp from Australian feedlot cattle

OBJECTIVE: To characterise eight isolates of a Gram-negative organism obtained from the upper respiratory tract of cattle showing evidence of mild upper respiratory tract disease. DESIGN: The isolates were compared with the five recognised species within the genus Mannheimia - M haemolytica, M glucosida, M granulomatis, M ruminalis and M varigena--using a range of phenotypic and genotypic methods. RESULTS: Phenotypic characterisation indicated that the isolates belonged to the trehalose-negative [Pasteurella] haemolytica complex. This complex has recently been reorganised into five species within the new genus Mannheimia. Ribotyping performed using HindIII and a computerised analysis system indicated that the eight Australian isolates formed a distinct cluster that was related to, but different from, the five recognised species of Mannheimia. The 16S rRNA sequence of one isolate (BNO311) was determined and a phylogenetic analysis performed. Isolate BNO311 was distinct from the five named Mannheimia spp but did join a larger cluster consisting of rRNA cluster IV (M varigena) and the unnamed rRNA cluster V of Mannheimia. DNA:DNA hybridisation between isolate BNO311 and M haemolytica NCTC 9380T, M granulomatis P411 and Actinobacillus ligniersii NCTC 4189T all suggested similarities of approximately 30%. CONCLUSIONS: These phenotypic and genotypic characterisation studies suggest that the eight Australian isolates represent a new species of Mannheimia. Until further characterisation studies are performed, we are unwilling to propose a name for this taxon, preferring to refer to this possible new species as Bisgaard taxon 39 of cluster V of Mannheimia.     

1株羊源溶血性曼氏杆菌的分离鉴定、药敏试验及致病性研究

[目的] 对某养殖场由呼吸道症状引发的山羊死亡病例进行病原学诊断,并对分离到的病原进行药敏试验及致病性分析。[方法] 无菌条件下剖检并采集死亡羊只肺脏及气管组织,接种于TSA固体培养基,37 ℃培养22~24 h;挑取疑似菌落,纯化后进行革兰染色镜检和生化鉴定;对经表型鉴定的分离菌株进行16S rDNA PCR扩增、测序,并进行遗传进化树构建和同源性分析;采用微量肉汤稀释法对分离菌株进行药敏试验;利用动物攻毒试验确定分离菌株对羔羊的致病性。[结果] 从临床样本中分离到1株细菌,命名为DMQ-Y-Mh。纯化后的分离菌株镜检为革兰阴性短杆菌,经生化鉴定以及16S rDNA PCR扩增、测序、同源性分析,将分离菌株鉴定为溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）。分离菌株对环丙沙星、阿奇霉素、庆大霉素敏感,对左氧氟沙星、土霉素、氟苯尼考中度敏感,对替米考星、恩诺沙星、泰乐菌素耐药。攻毒羔羊于72 h内死亡,剖检眼观气管及肺脏支气管内有黏性分泌物;肺脏组织有深红色病灶,与正常肺脏组织界限明显,可再次从死亡羔羊肺脏及气管组织分离到溶血性曼氏杆菌。[结论] 溶血性曼氏杆菌是造成该养殖场发生羊只死亡的病原菌,药敏试验结果为指导临床用药提供了参考。