柑橘黄龙病菌侵染对‘纽荷尔’脐橙组织结构的影响

【目的】了解‘纽荷尔’脐橙受柑橘黄龙病菌侵染后植株组织微形态结构的变化,以便进一步探明柑橘黄龙病对寄主的破坏特点及作用机制。【方法】通过电镜扫描、石蜡切片等技术观测感染柑橘黄龙病和健康脐橙的叶片、果蒂组织微形态结构,利用紫外可见分光光度计测定二者叶片光合色素、丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性变化,分析柑橘黄龙病侵染对寄主组织结构和生理生化的影响。【结果】柑橘黄龙病菌侵染后的脐橙叶片厚度变薄、气孔萎缩,栅栏组织细胞由长条形变为椭圆形、细胞间隙增大、排列松散,果蒂的韧皮部部分维管束堵塞。患病叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别是健康叶片的19.87%、22.13%和47.71%,MDA含量增加了120.39%,POD、CAT和SOD酶活性显著提升。【结论】柑橘黄龙病菌侵染后植株叶片叶绿素含量降低,严重影响光合作用,同时细胞受损程度加大,寄主抵御病原菌入侵和扩展能力减弱。     

‘Cocktail’葡萄柚黄龙病菌检测及鉴定

采用直接组织免疫印迹(Direct tissue blot immunoassay,DTBIA)和常规PCR技术,对采自广东梅州新建‘Cocktail’葡萄柚园内表现疑似黄龙病症状的样品进行检测。DTBIA检测发现疑似样品的韧皮部存在特征性紫红色反应,与黄龙病阳性对照反应一致。PCR检测发现枝条、叶片和果实样品中均检测出了黄龙病菌特异性条带,其中果蒂、中柱和种皮内病菌含量较高。进一步测序分析发现,来自‘Cocktail’葡萄柚病样的16Sr DNA和ef Tu基因与NCBI中的柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)对应基因的序列相似性均为100%,证实‘Cocktail’葡萄柚感染了柑橘黄龙病菌亚洲菌株。     

柑橘黄龙病菌亚洲种、虫媒及植物寄主互作研究进展

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)病原入侵寄主植物后不仅会对其代谢、激素调节、防卫反应等方面产生影响,同时,木虱获菌后,其发育、倾向性及内共生菌种群也会发生改变,病原还能通过改变寄主植物的挥发性信息物质等间接调控媒介昆虫行为。对黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)、虫媒及植物寄主互作相关研究进行综述,并对今后相关研究进行了展望,以期对柑橘黄龙病研究有所促进。     

赣州橘园根系内生丛枝菌根真菌群落多样性鉴定及其受黄龙病菌侵染的影响

【目的】鉴定赣州橘园黄龙病菌侵染和健康柑橘根系内生丛枝菌根真菌(AMF)的多样性,并明确黄龙病菌的侵染对于AMF群落的影响。【方法】使用AMF 18S小亚基核糖体特异引物AMV4.5NF/AMDGR对黄龙病菌侵染和健康柑橘根系DNA扩增建库,通过454高通量测序和生物信息学分析挖掘赣州橘园根系AMF多样性及其受黄龙病菌侵染的影响。【结果】从赣州橘园的柑橘根系中鉴定到80个AMF种,其中包括44个已知的AMF种和36个新种。进化分析发现,球囊霉属AMF占总AMF数的78.75%,是赣州柑橘根系内生AMF群落的优势菌属。鉴定到类球囊霉属的12个AMF,其中Paraglomus.N2和Paraglomus.N7的丰度位于总AMF的第二和第三,说明类球囊霉属AMF在赣州柑橘AMF群落中占有重要地位。PCoA分析表明黄龙病菌侵染显著改变了柑橘根系AMF的群落结构,而AMF群落的α多样性指数无显著性变化。通过丰度差异分析鉴定到6个在黄龙病菌侵染后丰度差异显著的AMF种,表明黄龙病菌侵染可能通过改变AMF菌种组成和相对丰度来影响其群落结构。【结论】全面揭示了赣州橘园根系内生AMF多样性,并且黄龙病菌侵染可通过改变菌种组成和相对丰度来影响AMF群落结构。     

广西综合防控柑橘黄龙病之体制机制探讨

柑橘是广西栽培面积最大,果品产量最多,社会消费面最广的水果之一.柑橘黄龙病是影响和制约广西柑橘产业发展的第一大毁灭性病害,广西许多柑橘产区果园因受柑橘黄龙病危害而毁于一旦.因此,如何有效防控好柑橘黄龙病的爆发危害,是广西柑橘产业发展急需研究解决的重要课题.总结分析广西综合防控柑橘黄龙病的成功经验和失败教训,可以说有效防控柑橘黄龙病的爆发危害不缺成熟的技术、成功的经验以及失败的教训,而是缺柑橘果园在不同经营体制下,落实综合防控柑橘黄龙病技术措施的有效机制.研究和探讨不同类型柑橘果园在不同经营体制下有效落实综合防控柑橘黄龙病技术措施的机制,对指导柑橘黄龙病的综合防控工作有着十分重要且积极的指导意义.笔者根据从事综合防控柑橘黄龙病近30年的实践经验和体会,对柑橘黄龙病爆发危害的原因进行了较为系统的总结分析,对几种不同类型果园在不同经营体制条件下,建立有效落实综合防控柑橘黄龙病技术措施的机制进行了较为全面地研究探讨,得出了建立有效防控柑橘黄龙病之体制机制的几点初步结论.     

柑橘黄龙病菌分泌蛋白05150的筛选、原核表达及抗血清制备

【目的】柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘产业的头号杀手,其病原主要是韧皮部杆菌属亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas),为革兰氏阴性菌,田间主要经亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)传播,为深入研究该病菌分泌蛋白的功能,笔者筛选其中1个分泌蛋白,进行原核表达并制备抗体。【方法】设定4点条件从Prasad等预测的166个分泌蛋白基因中筛选,与pET-28a构建重组表达载体,以原核表达的融合蛋白作为抗原,用于注射兔子,制备多克隆抗体。【结果】从预测的166个分泌蛋白基因中筛选出05150基因,成功构建表达载体pET-28a-05150,表达菌株pET-28a-05150在18℃、0.1 mmol·L~(-1) IPTG浓度条件下诱导的目的蛋白为包涵体。获得的pET-28a-05150抗血清通过ELISA效价为1∶4 000,通过dot ELISA检测手段可与田间感病样品发生显色反应,通过Western blot能与融合蛋白杂交出特异性条带。【结论】该研究筛选了CLas的分泌蛋白基因05150,以其体外表达蛋白制备了pET-28a-05150抗血清,为研究05150基因功能奠定前期基础,也为建立HLB的血清学检测手段及探究柑橘黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选方法提供参考。     

云南普文葡萄柚黄龙病病原分子检测及鉴定

为确定云南林科院普文林场葡萄柚试验园从美国佛罗里达州引种的葡萄柚品种是否感染黄龙病以及其病原类型,采集116个柑桔黄龙病疑似病样进行PCR检测、16SrDNA序列测定及系统进化分析。结果表明,116个样品中共有96个样品感染黄龙病,总感病率达到82.8%;在该试验园分离出的黄龙病菌16SrDNA的序列一致性达到100%,与NCBI中的柑桔黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)、柑桔黄龙病非洲种(Candidatus Liberibacter africanus)和柑桔黄龙病美洲种(Candidatus Liberibacter americanus)序列的相似性分别为100%、97.6%~98.5%和96.0%~96.7%。该试验园葡萄柚上的柑桔黄龙病菌属于亚洲种。     

应用DTBIA技术快速检测柑橘黄龙病菌研究

柑橘黄龙病病原菌为韧皮部限制性寄生菌Candidatus Liberibacter,迄今为止尚未成功获得离体纯培养。因此基于特异性抗体的高通量血清学检测技术迄今尚未开发。本实验室前期研究利用异源表达重组黄龙病菌外膜蛋白Omp_(CLas)免疫动物,制备并获得了特异性多克隆抗体(Anti-Omp_(CLas)-Pab)。本研究利用直接组织印迹免疫法(Direct tissue blot immunoassay,DTBIA)技术对获得的多克隆抗体的检测效果进行了初步评价,证实该抗体可以特异性识别中国不同地理来源的柑橘黄龙病菌分离物;柑橘叶柄、叶片中脉、枝条、根部、果梗和种子中均存在黄龙病菌,其中根部和种子中的病菌含量相对较低,枝条和叶片中脉中的含量较高。该多克隆抗体的获得为后续快速检测试剂盒或试纸条的研发奠定了基础。     

赣南柑桔木虱发生动态与携带黄龙病菌变化研究

为掌握近年来赣南柑桔木虱发生动态及其携带黄龙病菌变化情况,2016-2020年定点、定时监测了赣南10个县(区)20个正常管理果园的柑桔木虱成虫发生动态变化,并于2018年和2020年利用实时荧光定量PCR检测了 8个县(市)正常管理果园和失管果园柑桔木虱成虫带菌情况.结果表明,赣南地区柑桔木虱成虫发生高峰集中在5月下...     

中国柑橘黄龙病菌16S rDNA序列研究

 运用PCR技术对来自中国7省区不同寄主上的黄龙病菌16S rDNA基因区进行了PCR-RFLP-SSCP分析, 采用3种限制性内切酶进行单酶切、双酶切及三酶切反应,对酶切产物进行了单链构象多态性（SSCP）分析,结果表明来自7省区不同寄主上9个黄龙病病菌分离物的16S rDNA无可见变异;同时对9个代表性的分离物16S rDNA进行了克隆测序,序列多重比对结果与PCR-RFLP-SSCP一致,从而在分子水平上证明了中国柑橘黄龙病病菌的16S rDNA序列高度保守, 在不同的地域、寄主内没有发现分子变异,为进一步研究柑橘黄龙病菌系统进化奠定了基础。