柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的分离纯化

本文报道了柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的分离纯化方法。依次通过酶消化、离心洗涤、红细胞裂解、Percoll密度梯度离心等手段对鸡柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子进行了分离纯化,结果表明,该法效果好,回收率高,操作程序较简单,所获得的裂殖子杂质极少,其纯度适用于进行分子生物学方面的研究。     

柔嫩艾美球虫抗药株第二代裂殖子的双向电泳图谱比较

对实验室诱导的柔嫩艾美球虫马杜拉霉素、地克珠利抗药株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白质进行双向电泳，构建了稳定的双向电泳图谱。经Imagemaster 2D Elite软件分析，敏感株和抗药株平均可分离900个点；以敏感株平均胶作为参考胶，抗药株平均胶与之比较，得到差异蛋白质斑点，其中地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株各有4个表达差异点。这些差异表达的蛋白质可能参与了球虫抗药性产生的过程。     

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子表面抗原基因(λMZ5-7)的克隆及序列分析

本文选择E.tenella第2代裂殖子表面抗原基因（λMZ5－7）为侯选抗原基因，利用RT－PCR方法从E.tenella第2代裂殖子中扩增出了λMZ5－7基因，反这一片段克隆到PGEM－T－easy克隆载体上，得到的阳性克隆经PCR鉴定及酶切分析。结果表明，重组子（PGEM－T－λMZ）中含有λMZ5－7基因，且是正向插入的。核苷酸序列分析结果表明，该序列全长984bp，有一个开放阅读（933bp），与国外报道的λMZ5－7基因比较，同源性为98．8％，只是在335～347bp处缺少12bp，基余部分相同，缺少的12bp没有造成氨基酸编码的错位，缺少的4个氨基酸为Thr、Ser、Gln、Gln。克隆出的λMZ5－7基因可用于将来重组疫苗的研究。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖生殖阶段超微结构的研究

利用透射电镜对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella)裂殖生殖阶段的超微结构进行了观察描述。其第二次裂殖生殖方式为外裂殖生殖，裂殖子侵入宿主细胞后，裂殖子逐渐变圆形成裂殖体，此过程中裂殖子的棒状体首先消失，引后锥体和极环消失、最后微浅、淀粉颗粒和折光体消失。裂殖体长大后，细胞膜下陷，将裂殖体分成几个部分，随后裂殖体进行核分裂成多核裂殖体，此后在靠近细胞核处细胞膜加厚外突，临近部位的细胞膜凹陷，同时近突起部位内膜复合体加厚形成极环，随着时间的推移逐渐形成幼稚裂殖子，幼稚裂殖子后部与残体相连，此过程中裂殖子的锥、极环、微线、棒状体、淀粉颗粒、折光体依次逐渐形成。裂殖子成熟的标志为从残体脱离，裂殖子的膜下微管24根纵向贯穿裂殖子直达顶端和极环相连，裂殖子内部由锥体、锥体前环1、锥体前环2、极环、微线、线粒体、折光体和3－多个棒状体等组成。     

柔嫩艾美耳球虫的抗原分析

本文采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印渍技术，用抗柔嫩艾美耳球虫抗体分析了第二代型殖子、子孢子和未孢子化卵囊的蛋白质。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳银染表明第二代裂殖子主要蛋白质为：１７．６ＫＤ，２９．９ＫＤ，３８．９ＫＤ和５３．７ＫＤ，但用抗Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗体免疫印渍法检测出的主要抗原为：７８．０ＫＤ，８３．２ＫＤ和９５．５ＫＤ，这说明并不是含量高的蛋白质就是产生抗体的抗原；子孢子蛋白质含     

艾美耳球虫裂殖子的研究

艾美耳球虫裂殖子的研究谢明权，吴惠贤，张健，彭新宇，谢宏料（广东省农业科学院广州５１０６４０），（广东省农业科学院兽医研究所广州５１０６４０）球虫病是由艾美耳科原虫引起的寄生虫病，此病影响到哺乳类和禽类动物，尤其是鸡、火鸡、鹅、兔、牛，引起巨大的经济...     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。     

柔嫩艾美球虫杨凌株表面抗原SAG10基因的克隆与原核表达

从柔嫩艾美球虫第二代裂殖子总RNA中扩增＆SAG10基因，与pGEM-TEasy载体连接后转化大肠杆菌（E．coli）DH5a，筛选阳性克隆，扩增不舍N端信号肽的编码序列，分别插入表达载体pET-32a（＋）和pMAL-c2X，转化至E．coliRosetta，以IPTG诱导表达。结果表明，pET-32a（＋）-EtSAGIO在E．coliRosetta中的表达产物约占菌体总蛋白的43％，融合蛋白分子质量约为47ku，以包涵体形式存在；而pMAL-c2x-EtSAG10在E．coli Rosetta中表达的重组蛋白为可溶性，表达产物约占菌体总蛋白的35％，融合蛋白分子质量约为69ku。以表达的可溶性EtSAG10重组蛋白100μg／只肌肉注射免疫雏鸡，攻虫后以盲肠病变计分、盲肠卵囊数（OPG）、相对增重率和抗球虫指数（ACI）评价，免疫组相对盲肠卵囊产量为47．7％，抗球虫指数由86．79提高至152．13。提示，重组表达的EtSAG10可诱导雏鸡产生一定的抗球虫免疫保护。     

柔嫩艾美耳球虫MAGL基因的克隆及表达

酰基甘油酯酶(MAGL)是将酰基甘油分解为甘油和游离脂肪酸的丝氨酸水解酶家族成员之一,在酯代谢中起着关键酶的作用,是研制抗鸡球虫药物的重要靶标。本研究利用生物信息学技术预测拼接了柔嫩艾美耳球虫MAGL基因序列,以第二代裂殖子总RNA为模板,通过RTPCR技术获得Etmagl基因。将Etmagl与pCold-43a载体连接,构建pCold-43a-Etmagl重组载体,并在大肠杆菌BL21中获得可溶性蛋白,经亲和层析获得纯化的重组蛋白。结果显示,扩增的Etmagl序列ORF长1 752 bp,编码584个氨基酸,与预测序列相似度为99%,与弓形虫MAGL相似度好(55%);IPTG诱导后融合蛋白高效表达,大小约为114 ku,经免疫印迹鉴定为目的蛋白。本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了柔嫩艾美耳球虫酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶标的抗球虫药物筛选模型奠定了基础。     

银染mRNA差异显示法克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)抗药性相关基因

以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株、地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊为材料，用银染mRNA差异显示方法筛选和克隆与球虫抗药性相关的基因。首先提取这3个虫株孢子化卵囊的总RNA为模板．用Oligo（dT）12GG为锚定引物和2个10碱基随机引物组合进行RTPCR，产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。分别切取5务差异条带，进行2次PCR扩增，产物回收后与PGEM—T—easy Vector连接转化。经PCR鉴定正确后，再进行斑点杂交试验、序列分析和同源性比较。结果发现，地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株分离的差异片段中都有2个cDNA片段（可能为新的基因片段），这为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生的分子机理奠定了一定的基础。     

不同来源柔嫩艾美耳球虫虫株微线体3基因的克隆和序列分析

以8株不同来源柔嫩艾美耳球虫分离株为研究对象,对其艾美耳球虫微线体3(Eimeria tenella microneme protein,EtMIC3)基因进行了RT-PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的柔嫩艾美尔球虫相关序列进行比较,研究EtMIC3基因遗传变异情况。结果获得2976 bp的目的片段,各株与FJ374765.1 CDs的序列相似性在99.8%~99.9%之间,各株之间的序列相似性为99.9%~100.0%,各株编码的氨基酸序列与GenBank登记的柔嫩艾美耳球虫EtMIC3蛋白(ACJ11219)相似性在99.6%~99.9%之间,不同地理来源或耐药性虫株之间没有明显差异。本研究首次对中国EtMIC3基因进行了序列分析,结果显示不同来源株EtMIC3基因高度保守,为有效的疫苗候选因子,为进一步进行柔嫩艾美耳球虫基因工程疫苗构建的研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫病毒的鉴定

鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）的一种单细胞寄生性原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一,遍及世界各地。感染鸡的艾美耳属球虫中,国外已报道在巨型艾美耳球虫（E.maxima）,堆型艾美耳球虫（E.acervu-lina）,毒害艾美耳球虫（E.necatrix）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）中发现了病毒粒子或病毒RNA。但是作为危害最严重的柔嫩艾美耳球虫是否有病毒感染,国内外迄今尚无报道。本研究首次在柔嫩艾美耳球虫中发现病毒并对其进行了鉴定。通过核酸分析、RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和电镜形态观察对病毒进行鉴定。核酸酶的敏感性试验结果表明在柔嫩艾美耳球虫总核酸电泳图谱上观察到的大小分别为1.4、2.4和3.6kb的3条病毒带均不能被DNA酶（100mg/L）降解,但可被RNA酶（1.0mg/L）降解,表明这些核酸为RNA。另外,这些核酸不能被高盐浓度（0.3mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,但可被低盐浓度（0.015mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,并且采用α-32P标记的UTP掺入法测得该病毒样核酸具有RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）活性,表明这些核酸为双链RNA（dsRNA）。利用蔗糖梯度离心和透射电镜技术对柔嫩艾美耳球虫病毒进行了分离和鉴定。电镜负染观察到柔嫩艾美耳球虫病毒粒子外观呈球形,二十面体,无囊膜,直径38nm。     

鸡毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子的克隆、表达与虫体内定位

顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子。本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子,检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板,RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后,连接至pMD18-T载体,测序后构建pET28a (+)-EnApiAP2表达载体,转化至表达菌BL21(DE3),重组菌经测序鉴定后诱导表达,并纯化复性重组蛋白。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体。利用多克隆抗体,分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位。最后,应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示,该基因全长1 830 bp,编码610个氨基酸,含有一个AP2结构域,预测分子质量67.69 ku;重组蛋白大小约为74 ku,主要以包涵体形式存在,可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别;在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白,分子质量约为85 ku;EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内;第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P<0.01)。成功克隆、表达了EnApiAP2基因,证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内,为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础。     

鸡毒害艾美耳球虫LZ株MIC5基因的重组表达及其表达产物的抗原性分析

根据已发表的鸡柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）微线蛋白5（Micronemeprotein5,MIC-5）基因的核苷酸序列设计引物,以毒害艾美耳球虫（E．necatrix）DNA为模板,利用PCR方法扩增出EnMIC-5部分基因片段。将基因片段与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒测序结果表明EnMIC-5基因大小为1470bp,编码490个氨基酸。EnMIC-5与pET-28a（＋）载体构建重组表达质粒pET-EnMIC-5,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,表达产物为相对分子质量约57．5ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明表达蛋白可被鸡感染E．necatrix阳性血清识别。用重组蛋白免疫昆明鼠,一免后15d即可检测到相应抗体,且抗体在三免后40d仍维持较高水平,证实重组蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因的克隆、表达与蛋白结构预测

应用PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊子孢子cDNA表达文库中扩增得到鸡E.tenella杨凌株(YL)子孢子表面抗原3-1E基因。序列分析表明,E.tenella YL 3-1E基因的开放阅读框(ORF)为513个碱基,编码170个氨基酸,与报道的E.tenella甘肃株(GS)3-1E基因相似性为99.8%,两者推导的氨基酸序列相似性为99.4%;而与文献报道的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)美国株(US)3-1E基因序列的相似性为98.8%,推导的氨基酸序列相似性为98.8%。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功地表达出了分子量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫serpin基因克隆与生物信息学分析

根据GenBank发表的Eimeria tenella serpin(Etserpin)基因设计1对引物,从孢子化卵囊总RNA中用RT-PCR方法扩增Etserpin基因,克隆后测序,应用生物信息学分析预测其核苷酸及其编码蛋白的结构与功能.结果表明,Etserpin开放阅读框为1 248 bp,编码一分泌蛋白,N端具有1个28 aa的信号肽,有1个跨膜区域,有2个糖基化位点和21个磷酸化位点,88,89,98～101,208～212,283～287,302～304区段是其可能的B细胞表位;同源性比对与进化树的分析表明其为抑制性serpin蛋白,结构保守,与F.acervulina、T.gondii和N.caninumm亲缘关系较近.二级结构以α螺旋和随机卷曲为主,具有类似于serpin家族蛋白的三级结构.