新疆某地牛病毒性腹泻病毒生物型的鉴定

从临床怀疑为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染奶牛的血液中用RT-PCR方法检测BVDV,目的片段回收克隆测序,经Blast分析,与匈牙利疫苗致弱株同源性99%,并用PCR方法鉴定基因型,均为BVDV-Ⅰ型.用MDBK细胞鉴定生物型,不致细胞病变,为非致细胞病变(nCP)型.     

不同生物型BVDV感染对MDBK细胞类泛素基因转录水平的影响

探讨牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对牛胚肾细胞(MDBK)类泛素基因转录水平的影响。对致细胞病变型(cp型)BVDV标准株NADL毒株及非致细胞病变型(ncp型)BVDV分离株shz 132毒株进行增殖,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应测定2种病毒拷贝数,按照Reed-Muench法测定BVDV NADL病毒TCID50值。以100TCID50BVDV NADL病毒和同等拷贝数的BVDV shz 132病毒分别感染MDBK细胞不同时间(4、12、24、48h)后收集细胞,提取细胞总RNA,反转录得到cDNA。以cDNA为模板,采用特异性引物,通过RT-qPCR反应检测细胞类泛素基因SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9的转录水平。结果显示,致细胞病变型BVDV NADL感染MDBK细胞48h,引起细胞显著的病变,而非致细胞病变型BVDV shz 132感染不引起细胞病变。BVDV NADL和shz 132的病毒拷贝数分别是1.13×1011 copies/mL和1.77×1011 copies/mL,BVDV NADL的TCID50是10-4.9 TCID50/0.1mL。RT-qPCR分析显示,与对照组相比,2种BVDV病毒感染都能引起MDBK细胞SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9基因的相对表达量变化。在BVDV shz 132感染的细胞中,SUMO1、SUMO2、SUMO3的相对表达量在各个感染时间都高于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,以上3个基因的相对表达量下调,差异极显著(P0.01);而Ubc9基因的相对表达量则低于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,其相对表达量上调,差异极显著(P0.01)。结果表明,BVDV感染调控了MDBK细胞SUMO系统,提示细胞SUMO系统参与了BVDV在胞内的活动,且这种调控作用与病毒的生物型存在密切联系。     

不同生物型牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞后免疫相关基因表达谱分析

为研究牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染细胞后的免疫相关基因在不同时间差异表达,以及细胞病变型（CP）和非致细胞病变型（NCP）牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞后免疫相关基因表达差异及功能,本研究采用基因表达谱芯片技术,将BVDV NM01株和JL株分别接种MDBK细胞,同时设正常细胞对照,分别将接种48 h、72 h和96 h后的细胞和对照细胞收集,提取总RNA,进行免疫相关基因扫描分析。实验结果显示：BVDV感染后48 h,MN01株病毒感染细胞有9个基因上调,1个基因下调;JL株有3个基因上调,3个基因下调;感染后72h,MN01株病毒感染细胞有33个基因上调,14个基因下调;JL株有15个基因上调,8个基因下调;感染后96 h,MN01株病毒感染细胞有43个基因上调,30个基因下调;JL株有7个基因上调,7个基因下调。通过研究不同生物型BVDV感染MDBK细胞后相关免疫基因表达情况,为进一步了解BVDV感染细胞的免疫机理提供了线索。     

牛病毒性腹泻病毒XC株的分离与鉴定

将BVDV阳性血清样品接种MDBK细胞,结果分离出1株BVDV。采用MDBK细胞培养法、直接免疫荧光、RT-PCR与TCID_(50)等方法对分离毒株进行鉴定分析。结果表明,分离株在MDBK细胞上盲传至10代均未出现细胞病变;在直接免疫荧光试验中呈阳性;RT-PCR扩增均获得5'-UTR、Npro预期大小DNA片段;分离株滴度为10~(-5.9)TCID_(50)/0.2 mL。进化分析显示,该分离株属于BVDV-1m。以上结果推断,成功分离鉴定1株BVDV,该分离株为非致细胞病变型BVDV-1m,命名为BVDV-1 XC株,为研究致病机理奠定基础。     

HEBP1基因敲除对牛病毒性腹泻病毒在MDBK细胞中增殖的影响

为研究血红素结合蛋白1(HEBP1)对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的影响,应用CRISPR/Cas9技术建立HEBP1基因敲除的MDBK细胞系;用BVDV TC株感染HEBP1基因敲除的MDBK细胞,用免疫荧光染色检测BVDV双链RNA(dsRNA)水平,观察BVDV致细胞病变效应(CPE)情况,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测BVDV 5′UTR mRNA水平,Reed-Muench测定病毒滴度变化。结果表明,成功构建HEBP1基因敲除的MDBK稳定细胞系,敲除效率为72.41%;敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV 5′UTR mRNA和dsRNA积累,减弱BVDV感染靶细胞的CPE,降低BVDV滴度。说明敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV的复制,为抗BVDV研究提供新的思路和药物靶点。     

藏羊源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及生物学特性分析

为了确定临床病例的致病原,并掌握该致病原的生物学特性,试验采用PCR检测、病毒分离培养与细胞病变观察、PCR分型鉴定、间接免疫荧光试验、中和试验、生物学特性检测等方法对临床病料样品进行研究。结果表明:病料样品经牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性引物检测为阳性,病料样品可引起MDBK细胞出现典型的圆缩、拉网等细胞病变现象,PCR分型鉴定中分离毒株经BVDV-1特异性引物检测为阳性,间接免疫荧光试验中分离毒株可引起MDBK细胞出现特异性荧光,中和试验中分离毒株可被BVDV阳性血清特异性中和,分离毒株的TCID_(50)为1×10~(-5.61)/0.1 mL,对5-氟脱氧尿核苷不敏感,对乙醚、氯仿、胰蛋白酶等敏感,对酸性敏感,对碱性不敏感,54℃1 h可灭活。说明临床病例的致病原为藏羊源BVDV毒株。     

2株牛病毒性腹泻病毒基因2型的分离鉴定

为了对疑似污染牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的牛肾细胞系(MDBK)进行检测并分离鉴定病毒,采用RTPCR、间接免疫荧光、电镜观察、病毒序列的分子进化分析等方法对细胞中污染的BVDV进行鉴定。结果显示:从2株不同来源的污染细胞中检测到2株BVDV(C201602和C201704),RT-PCR均可扩增得到288 bp的5'-UTR片段,进化分析表明其均为BVDV-2a型;2株病毒接种MDBK细胞传代,均无细胞病变产生,测得第3代病毒效价分别为105和104.5TCID50/m L,电镜观察病毒为50~60 nm的圆形有囊膜颗粒。研究表明,BVDV-2具有潜在的流行风险,为试验材料中BVDV-2污染的风险控制提出了警示。     

不同生物型BVDV感染宿主细胞后差异基因分析

为深入研究牛场中普遍存在的持续性感染,探讨不同生物型牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）转化的分子机制,本试验将致细胞病变型BVDV （CP型BVDV）和非致细胞病变型BVDV （NCP型BVDV）感染MDBK细胞,观察细胞变化,感染后12~72 h期间每间隔12 h收集1次细胞,同时对24、48 h收集的细胞进行转录组学分析。结果显示,不同生物型BVDV感染宿主细胞24 h后,与感染NCP型BVDV的细胞相比,感染CP型BVDV的MDBK细胞中上调差异表达的基因2 849个,下调差异表达的基因3 347个,48 h后,上调差异表达的基因2 933个,下调差异表达的基因2 831个。对差异基因的GO功能分析结果表明,差异基因参与的分子功能主要有催化活性、结合活性、酶调节活性、分子转导活性和蛋白结合转录因子活性等;Pathway显著性富集分析结果显示,差异表达基因主要参与细胞自噬、细胞凋亡、免疫调节因子等相关的信号通路。本试验结果可为进一步揭示病毒致病的分子机制、控制BVDV和研制其候选疫苗奠定基础。     

3株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其基因分型

为确定牛呼吸道传染病的病原以及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在临床健康牛群中是否存在持续性感染,本研究采集了内蒙古自治区和黑龙江省两个牛场牛鼻拭子46份及肺脏样品8份,采用MDBK细胞进行病毒分离培养,经BVDV特异性引物RT-PCR检测有3份样品为阳性。利用间接免疫荧光检测3株阳性样品,可以观察到特异性荧光,表明分离得到3株BVDV,分别命名为480、A0583和Lung-6。进一步研究显示480、A0583和Lung-6均为非致细胞病变型。对3株分离病毒的5'端非编码区和Npro基因进化树分析显示3株病毒均属于BVDV1型,其中480株属于BVDV1c亚型,A0583株和Lung-6株同属于BVDV1m亚型。本研究首次在国内同一个牛场分离到BVDV1m(A0583)和BVDV1c(480)两个基因亚型。本研究为我国BVDV-1型不同基因亚型的抗原关系分析及BVDV疫苗的研制奠定了基础。     

胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒2型毒株分离及脱脂奶粉中抗体的检测

本研究旨在对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）进行分离及鉴定。利用BVDV抗原和抗体检测试剂盒检测,提取胎牛血清中的病毒RNA,用5'-UTR巢式PCR进行扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T进行测序分析。胎牛血清样品接种MDBK细胞,进行细胞传代培养,通过细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测对实验室进口胎牛血清样品进行病毒分离及鉴定,应用DNAStar对BVDV 5'-UTR、N^pro与GenBank中公布的瘟病毒参考株进行多序列比对,采用Mega 6.0进行遗传进化分析。同时通过包被脱脂奶粉进行间接ELISA检测其中的BVDV抗体。结果显示,胎牛血清中BVDV抗原和抗体均为阳性,并且从胎牛血清中成功分离到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-GC株,该病毒株在MDBK细胞上进行增殖培养时未能引起细胞病变;5'-UTR与N^pro PCR扩增为阳性,扩增产物大小均与预期相符;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10^-3.6TCID₅₀/0.1 mL;遗传进化分析表明,该分离株与USMARC-60779（BVDV-2）株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-2型毒株;通过包被脱脂奶粉和商品化的ELISA试剂盒进行检测,结果表明脱脂奶粉中存在BVDV抗体。本研究从进口胎牛血清中分离出1株BVDV-2型非致细胞病变病毒,从脱脂奶粉中检测到BVDV抗体,表明进口胎牛血清和脱脂奶粉中都存在BVDV抗原和抗体污染,本研究为后续试验分析提供参考。     

吉林某牛场牛病毒性腹泻流行病学调查及分析

为全面了解吉林省某规模化牛场牛病毒性腹泻(BVD)的流行情况,试验采集临床血清样品157份,粪便样品18份,肝脏、精液等组织样品17份,应用BVDV抗体检测试剂盒进行血清抗体检测,利用BVDV1型引物,采用纳米PCR方法对血清及临床样品进行BVDV抗原检测,对抗原阳性样品进行测序分析;将抗原阳性样品经研磨、稀释后用0.22μm滤膜过滤除菌,接入牛肾细胞(MDBK)进行病毒分离培养,盲传3代后再次进行抗原检测;采用免疫荧光技术检测病毒对MDBK细胞的侵染作用;利用Mega软件绘制系统进化树并进行同源性比对分析。结果显示,该牛场临床血清BVDV抗体阳性率为77.1%,血清抗原阳性率为12.1%,临床粪便等样品抗原阳性率为74.3%;病料接入细胞未观察到细胞病变,分离毒株PCR产物测序分析结果与样品抗原检测结果一致;免疫荧光检测结果显示,分离株毒液正常吸附于MDBK细胞中,有明显荧光反应;抗原测序分析显示,该牛场BVD主要流行毒株与BVDV JL-1株同源性高达99.0%,且均为BVDV 1型毒株。本研究对该牛场BVDV流行情况进行了全面调查,为开展净化工作奠定了基础。     

鹿源牛病毒性腹泻病毒敏感中药筛选的研究

为筛选鹿源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)敏感中药,试验采用组织细胞培养方法测试了4种中药在牛肾细胞(MDBK)体外培养中的最大安全浓度和对鹿源BVDV敏感性。结果表明:4种中药对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度分别是黄芪25、鱼腥草28、莪术油27、双黄连27;4种中药抗梅花鹿源BVDV作用由强到弱的顺序为莪术油、鱼腥草、黄芪、双黄连。     

吉林某牛场牛病毒性腹泻流行病学调查及分析

为全面了解吉林省某规模化牛场牛病毒性腹泻(BVD)的流行情况,试验采集临床血清样品157份,粪便样品18份,肝脏、精液等组织样品17份,应用BVDV抗体检测试剂盒进行血清抗体检测,利用BVDV1型引物,采用纳米PCR方法对血清及临床样品进行BVDV抗原检测,对抗原阳性样品进行测序分析;将抗原阳性样品经研磨、稀释后用0.22μm滤膜过滤除菌,接入牛肾细胞(MDBK)进行病毒分离培养,盲传3代后再次进行抗原检测;采用免疫荧光技术检测病毒对MDBK细胞的侵染作用;利用Mega软件绘制系统进化树并进行同源性比对分析。结果显示,该牛场临床血清BVDV抗体阳性率为77.1%,血清抗原阳性率为12.1%,临床粪便等样品抗原阳性率为74.3%;病料接入细胞未观察到细胞病变,分离毒株PCR产物测序分析结果与样品抗原检测结果一致;免疫荧光检测结果显示,分离株毒液正常吸附于MDBK细胞中,有明显荧光反应;抗原测序分析显示,该牛场BVD主要流行毒株与BVDV JL-1株同源性高达99.0%,且均为BVDV 1型毒株。本研究对该牛场BVDV流行情况进行了全面调查,为开展净化工作奠定了基础。     

胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒2型毒株分离及脱脂奶粉中抗体的检测

本研究旨在对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)进行分离及鉴定。利用BVDV抗原和抗体检测试剂盒检测,提取胎牛血清中的病毒RNA,用5′-UTR巢式PCR进行扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T进行测序分析。胎牛血清样品接种MDBK细胞,进行细胞传代培养,通过细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测对实验室进口胎牛血清样品进行病毒分离及鉴定,应用DNAStar对BVDV 5′-UTR、N~(pro)与GenBank中公布的瘟病毒参考株进行多序列比对,采用Mega 6.0进行遗传进化分析。同时通过包被脱脂奶粉进行间接ELISA检测其中的BVDV抗体。结果显示,胎牛血清中BVDV抗原和抗体均为阳性,并且从胎牛血清中成功分离到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-GC株,该病毒株在MDBK细胞上进行增殖培养时未能引起细胞病变;5′-UTR与N~(pro) PCR扩增为阳性,扩增产物大小均与预期相符;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10~(-3.6)TCID_(50)/0.1 mL;遗传进化分析表明,该分离株与USMARC-60779(BVDV-2)株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-2型毒株;通过包被脱脂奶粉和商品化的ELISA试剂盒进行检测,结果表明脱脂奶粉中存在BVDV抗体。本研究从进口胎牛血清中分离出1株BVDV-2型非致细胞病变病毒,从脱脂奶粉中检测到BVDV抗体,表明进口胎牛血清和脱脂奶粉中都存在BVDV抗原和抗体污染,本研究为后续试验分析提供参考。     

小分子药物索非布韦对牛病毒性腹泻病毒体外复制的影响

试验旨在研究小分子药物索非布韦是否具有抑制牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）复制的作用。通过MTT法测定了不同时间和不同浓度索非布韦对牛肾细胞（MDBK）增殖的影响;采用免疫荧光染色试验筛选出能有效抑制BVDV复制的索非布韦最适浓度,用实时荧光定量PCR、致细胞病变作用（CPE）和病毒半数组织细胞感染量（TCID₅₀）测定的方法检测索非布韦对BVDV复制的影响。结果显示,索非布韦处理MDBK细胞24和48 h能极显著抑制细胞增殖（P<0.01）;与对照组相比,当索非布韦浓度为800 μmol/L时免疫荧光染色检测BVDV感染MDBK细胞的双链RNA（dsRNA）含量极显著降低（P<0.01）;实时荧光定量PCR检测发现,与DMSO处理组相比,BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞,BVDV 5'UTR mRNA含量在病毒感染24和48 h时极显著降低（P<0.01）;BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞病变现象明显减弱;索非布韦处理24 h后能极显著减弱BVDV感染MDBK细胞后子代病毒颗粒的形成组与释放（P<0.01）,降低病毒滴度。综合上述结果表明,小分子药物索非布韦能有效抑制BVDV体外复制。     

鹿源牛病毒性腹泻病毒敏感中药筛选的研究

为筛选鹿源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)敏感中药,试验采用组织细胞培养方法测试了4种中药在牛肾细胞(MDBK)体外培养中的最大安全浓度和对鹿源BVDV敏感性.结果表明:4种中药对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度分别是黄芪25、鱼腥草28、莪术油27、双黄连27;4种中药抗梅花鹿源BVDV作用由强到弱的顺序为莪术油、鱼腥草...     

不同细胞进行牛血清中牛病毒检测的比较试验

选出最适合牛血清中外源病毒增殖的细胞,用于牛血清中病毒检测,可以提高血清中病毒的检出率,以确保用于疫苗生产的牛血清是安全可靠的。将牛腹泻病毒、牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒和狂犬病毒接种到培养好的MDBK细胞、VERO细胞、BT细胞中,逐日观察细胞的病变情况,待观察到10%细胞出现病变或者培养7天后,进行免疫荧光染色,选择出适合用于此六种病毒增殖的细胞系。结果显示BT细胞对所有病毒敏感,vero细胞对BAV、BVDV病毒不敏感,MDBK对REO、BVDV、RV三种病毒不敏感。综合比较后,选择BT细胞为BPIV、BPV、BAV、BVDV的增殖及实验用细胞,vero细胞为REO、RV的增殖及实验用细胞,为了提高血清中病毒的检出率,可以选用多种细胞进行同时实验。     

牛病毒性腹泻病毒长春分离株P125基因的克隆与序列测定

以MDBK细胞培养细胞病变型牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NCD毒株，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，并根据BVDVNADL参考株序列设计合成的1对引物（W1与W2），进行反转录PCR（RT-PCR），扩增出P125基因约400bp的片段。经PGEM-T载体连接后克隆、测序，并与巳发表的NADL、Osloss、SD-1、184、D、H、Yak等BVDV毒析序列进行比较。结果表明：NCD株P125基因区无插入或缺失变异，但存在着核苷酸的替换；经聚类分析初步认为NCD株属于Ia型。NCD株与长春184、H株核苷酸序列差异较大，而亲缘关系较近，表明BVDV在同一地区存在不同进化来源的毒株。     

Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定

为了解内蒙古呼和浩特部分地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况,本研究采用RTPCR技术从采集自内蒙古某屠宰场的32份牛肺脏样品中检测出两株BVDV,命名为BVDV-HT1704、BVDV-HT1723株。通过在MDBK细胞上传代、免疫荧光试验、5’-UTR基因序列测定及分子进化分析对检测出BVDV阳性的肺脏组织进行鉴定。结果显示:在MDBK细胞中盲传10代后没有病变产生;经IFA检测,在病毒感染的细胞浆内产生特异性荧光;序列同源性和系统进化分析表明该毒株属于BVDV-Ⅱa型,且两株分离株属于单一的分支。本研究首次在我国正常牛肺脏组织中分离到BVDV,为了解BVDV在内蒙古自治区的流行情况及地理分布提供依据,并为相关疫苗的研发奠定了基础。     

梅花鹿α干扰素基因在MDBK细胞中表达及抗BVDV活性检测

采用基因工程技术克隆出梅花鹿α干扰素(IFN-α)成熟肽基因序列,并将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0(+),经酶切、PCR及测序鉴定,成功构建了pcDNA3.0-IFN-α真核重组表达质粒。将鉴定正确的阳性重组质粒经非脂质体法转染至MDBK细胞,间接免疫荧光试验检测其具有较高转染效率;Western blot法检测IFN-α蛋白在MDBK细胞中得到有效表达;病变抑制试验检测转染后的MDBK细胞具有明显抗BVDV活性;抗BVDV活性的定量试验表明转染pcDNA3.0-IFN-α质粒的MDBK细胞与感染未转染的MDBK细胞相比抗BVDV活力提高了66192倍。本试验在MDBK细胞中成功表达了梅花鹿IFN-α,并检测出其具有明显抗BVDV作用,这为梅花鹿IFN-α活性机理研究以及开发更高效的抗梅花鹿病毒性疾病干扰素制剂提供物质和理论基础。