工程菌DH5a感受态细胞的制备及质粒pGEM的转化研究

 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是源于海洋生物多管水母(aequoia victoria)的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光，能在活细胞内稳定表达，本试验首先从含有GFP的大肠杆菌中提取质粒，并利用胶回收试剂盒纯化质粒，采用氯化钙法将工程菌DH_5a制成感受态细胞，然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞中，使得工程菌DH_5a转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌，并表达绿色荧光蛋白，接种于加氨苄青霉素的LB培养基上，筛选阳性克隆。     

影响生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞效果的因素研究

旨在分析生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)转染效果的影响因素,探讨最佳转染条件,为进一步研究生长抑素基因疫苗的作用机制和作用效果奠定基础。以脂质体转染法将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞,探讨质粒转染HeLa细胞最佳条件的4个参数:质粒DNA剂量、脂质体剂量、最佳转染时间和质粒提取方法,在荧光显微镜下观察细胞转染情况并计算转染率。结果:在六孔细胞培养板上,当DNA/脂质体剂量为1μg/6μg时,转染效率最高,在转染后72 h达到34.02%;当用Plasmid Maxi Kit试剂盒提取质粒,转染时间为48 h,转染效率最高,达到17.88%。重组质粒pEGS/2SS转染He-La细胞条件是:采用试剂盒(Plasmid Maxi Kit)提取的质粒,DNA和脂质体的剂量分别为1μg与6μg,转染时间48 h,此时的转染效率最高,达17.88%。     

内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按10³～10⁷拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r²=0.998、r²=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%(10⁷拷贝/反应除外),说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。     

λ噬菌体cDNA文库向质粒cDNA文库转化的研究

尽管以λ噬菌体载体系统构建的cDNA文库具有装载容量大、质量高、代表性好、适合长期保存等优点,但是噬菌斑铺平板培养不但工作量大、费时费力,而且效率很低。此外,以λ噬菌体载体系统构建的cDNA文库可采用的筛选方法有限,不能对文库进行功能性筛选。根据λTriplEx2噬菌体能利用重组酶自身环化成质粒pTriplEx2这一原理,通过随机挑选多个分界良好的噬菌斑转导入E.coli BM25.8菌中将噬菌体转化为质粒的实验,说明是一种实现cDNA文库功能性筛选简单而有效的方法,打破了噬菌体文库筛选方法的局限性,在功能基因组学研究方面具有广阔的应用前景。     

猪Ghrelin真核表达质粒的制备及对小鼠生长的影响

通过RT-PCR获得猪 Ghrelin基因的cDNA片段,克隆入pcDNA3.1(+)质粒中构建真核表达质粒,将质粒注射到断奶的昆明小鼠的后腿肌肉中,研究Ghrelin真核表达质粒对小鼠生长的影响。结果表明,试验组小鼠在试验第10、20、35 d的增重高于对照组,而在试验结束的第46 d增重无显著差异。说明Ghrelin基因真核表达质粒有促进小鼠生长的作用。     

PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因重组真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)已知序列设计3对引物,采用RTPCR方法扩增PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因,目的基因依次插入真核表达载体pcDNA4.0,经PCR、酶切及测序分析,重组质粒构建成功,并命名为pcDNA4.0-ORF5-E2.重组质粒回收提纯后,以100 μg/只剂量免疫小鼠,免疫3次.三免后10 d采血并制备血清,用间接ELISA检测小鼠血清中PRRSV及CSFV抗体效价.结果显示,所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生PRRSV及CSFV抗体.     

猪IFN-γ和IL-4重组质粒对口蹄疫疫苗的免疫佐剂效应研究

为了研究猪IFN-γ和IL-4对疫苗的免疫佐剂效应,用pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4的重组质粒与口蹄疫双价疫苗配伍免疫小鼠,检测小鼠抗口蹄疫抗体水平和CD4＋/CD8＋T细胞比值的动态变化,观察其免疫佐剂效应。结果表明pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4重组质粒都能显著提高小鼠抗口蹄疫抗体水平（P〈0.01）,其中pcDNA3.1/IFN-γ提高亚洲Ⅰ型FMD抗体水平的佐剂效应较pcDNA3.1/IL-4的显著（P〈0.01）,而pcDNA3.1/IL-4提高O型FMD抗体水平的佐剂效应显著高于pcDNA3.1/IFN-γ（P〈0.01）,pcDNA3.1也显示出了一定的佐剂效应;免疫后不同时间pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4组CD4＋/CD8＋T细胞比值显著高于其他组（P〈0.01）,且第21天与第7、45天的差异极显著（P〈0.01）。     

三道眉草鹀消化道5-羟色胺细胞的分布及形态学研究

为了研究三道眉草鹀消化道5-羟色胺(5-HT)免疫活性内分泌细胞的分布及形态,试验采用免疫组织化学法对其进行了研究。结果表明:三道眉草鹀消化道除食管未发现5-HT细胞外,其他部位均有5-HT细胞分布,且分布密度呈"N"型,直肠部5-HT细胞的分布密度最大,空肠和十二指肠分布密度次之,而腺胃分布密度最低;5-HT细胞有锥体形和圆形,主要分布于腺泡上皮、肠黏膜上皮之间。说明5-HT细胞的分布、形态与其消化道不同部位的生理功能及内、外分泌方式有关。     

pGRF基因质粒对猪生产性能、胴体品质及内脏器官的影响研究

试验选用30头杜洛克×太湖和汉普夏×太湖二元杂仔猪,平均44日龄断奶,体重10.30kg±1.80kg,研究了经腿部肌肉注射0、0.25、0.5、1.0和2.0mgpGRF基因质粒对猪生产性能、胴体品质及内脏器官的影响。猪达100kg体重时结束试验,各处理组各选3头猪屠宰。0mg,1mg,2mg组3头屠宰猪进行胴体分割。试验结果表明,10￣20kg阶段以0.5mg的效果最佳,日增重(ADG)和每千克增重耗料(F/G)较对照组分别提高28.3%(P<0.10)和减少12%(P<0.05),0.5mg与1mg和2mg之间无显著差异。20￣40kg阶段以1mg最佳,ADG较对照组提高17.51%(P<0.05),F/G减少15.7%(P<0.05);1mg与2mg之间无显著差异;40￣100kg阶段以2mg最佳,ADG较对照组高5.38%(P>0.05),F/G减少14%(P<0.05),2mg与1mg无显著差异。100kg屠宰,2mg组对胴体品质改善最明显,瘦肉率提高3.59%,眼肌面积提高11.8%,三点膘厚降低6.2%;内脏器官的大小、重量与对照组均无显著差异。     

益生乳酸杆菌抑制大肠杆菌的研究

本试验在分离选育出一批抗逆性较强的乳酸杆菌之后 ,测定了从胃粘膜分离筛选出的三株乳酸杆菌的乳酸产量、乳酸杆菌前期代谢产物的抑菌作用和乳酸杆菌及其代谢产物的协同抑菌作用。结果表明 ,乳酸杆菌代谢产物中乳酸不是唯一起抑菌或灭菌作用的代谢物。乳酸杆菌代谢产物对不同血清型大肠杆菌的抑制效果和乳酸杆菌及其代谢产物联合对大肠杆菌的抑菌作用相似 ,即抑制或杀灭大肠杆菌K88和K99较强 ,而对 987P的抑制作用较弱。同时 ,乳酸杆菌的菌体及其代谢产物对大肠杆菌具有一定的协同抑制作用。     

猪场环境大肠埃希菌耐药质粒消除研究

为了解耐药质粒消除对大肠埃希菌耐药性及其他生理特性的影响,参考前期试验分离出的8株携带aac(6')-Ib质粒耐药基因的大肠埃希菌的药敏试验.选取1株耐药性最强菌株用高温及SDS进行耐药质粒消除,PCR检测aac(6')-Ib基因.结果显示,耐药质粒成功消除,耐药性消失,且细菌在不含抗生素条件下培养,耐药性消除状态可稳...     

陕西某种鸡场大肠埃希菌血清型调查与灭活苗研制

为控制大肠埃希菌病的危害,对从陕西某种鸡场分离鉴定的20株鸡大肠埃希菌进行了血清型调查,结果O2型5株、O6型3株、O78型4株,未定型8株,表明鸡场的大肠埃希菌有了新的流行菌株O6出现。用定型的分离菌株研制的自家灭活菌苗免疫接种雏鸡,7 d后可检测到抗体,14 d产生免疫保护力。29日龄二免,90 d后抗体水平仍在5log2以上。119日龄三免,免疫后5个月抗体水平仍维持较高,但6个月后,抗体水平已在5 log2以下,失去保护力。通过3年的应用,该场种鸡大肠埃希菌病的平均死亡率由6.7%下降至1.6%,雏鸡死亡率由4.2%下降至1.8%,差异极显著(P<0.01)。     

鸭疫里氏杆菌-大肠杆菌二联灭活疫苗的研制

从河北某肉鸭场的发病鸭中分离出鸭疫里氏杆菌（Riemerella.anatipestifer，RA）BJ-D-1株，对该菌株采用液体培养、固体培养及鸡坯培养等三种不同方法进行增菌培养，然后与大肠杆菌O1、O2、O78株及河北地方大肠杆菌流行株等的浓缩菌液以一定比例混合，制成油乳剂灭活苗。皮下免疫7日龄雏鸭0.5mL/只。在河北某发病肉鸭场及周围肉鸭场进行田间试验，效果良好。     

重组绵羊pEGFP-PRNP质粒构建及真核细胞转染

构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。     

猪巴氏杆菌、大肠杆菌二联苗的制备及免疫效果观察

以分离某猪场的多杀性巴氏杆菌、致病性大肠杆菌制备猪巴氏杆菌和大肠杆菌二联灭活苗,同时选择病变明显的病料制备组织灭活苗,探讨它们的免疫效果。结果发现它们的免疫保护率分别为：二联灭活苗为80%以上,组织灭活苗为60%。因此二联苗可试用于控制该猪场巴氏杆菌病的流行。     

青蒿素对腹泻仔猪病原大肠杆菌的抑菌效果

目前,常用抗生素防治仔猪大肠杆菌感染性腹泻,但动物长期大量滥用抗菌药物,易破坏肠道正常菌群,增加感染性,造成反复感染和继发感染,同时易造成细菌耐药性的增加.青蒿素是公认的中药产品,具有过氧基团的倍半萜内酯化合物,因其对疟疾具有"高效、速效、低毒"的突出疗效,已经成为越来     

抗猪大肠杆菌卵黄抗体变化规律及在体外对大肠杆菌生长的影响

试验研究抗猪大肠杆菌卵黄抗体变化规律及在体外对大肠杆菌生长和对肠黏膜细胞上粘附的影响。试验选用 30周龄海兰褐壳蛋鸡 2 4 0只 ,试验时间 80d。以K88、K99和 987P 3种大肠杆菌混合液为免疫原 ,免疫原中K88、K99和 987P的细菌数分别为 2 .5× 10 9、2 .5× 10 9、2 .5× 10 10 CFU/mL。免疫剂量为 0 .5、1.0、1.5、2 .0mL/只 ,在试验鸡胸腹部肌肉、分多点注射 (每点约 0 .2mL) ,每个免疫剂量免疫健康蛋鸡 5 0只 ,4 0只蛋鸡作对照 ,以个体为单位 ,每天收集鸡蛋 ,4℃保存。在每次免疫 5d后 ,翅静脉采血、分离血清 ,- 2 0℃保存。用盐析法和冷冻干燥法制备抗猪大肠杆菌卵黄抗体粉 ,配制不同蛋白含量的卵黄抗体溶液 ,用体外法研究卵黄抗体对大肠杆菌生长及对肠黏膜细胞粘附的影响。试验结果表明 :最佳免疫剂量为 1.0mL/只 ,卵黄与血清中的抗体水平没有差异 ;在大肠杆菌培养液中 ,添加蛋白含量为 0 .5mg/mL抗猪大肠杆菌卵黄抗体溶液时 ,大肠杆菌的生长受到抑制 (P <0 .0 5 ) ,不同卵黄抗体间没有交叉反应 ;蛋白含量为 0 .2 5mg/mL的抗猪大肠杆菌卵黄抗体溶液对大肠杆菌在肠黏膜细胞上的粘附有抑制作用 (P <0 .0 5 )。     

兔大肠杆菌耐药性调查

从璧山、铜梁、荣昌、渝北的4个区县的6个兔场18只病兔中采集病料,分离出6株细菌.镜检、动物试验、生化鉴定及药敏试验证明,分离细菌属于致病性大肠杆菌.药敏试验结果是.6株菌对丁胺卡那霉素、阿奇霉素敏感,对氨苄青霉素、先锋Ⅳ、先锋Ⅴ、氟苯尼考、庆大霉素、复方磺胺、四环素、卡那霉素都有不同程度的耐药性.     

单诺沙星和恩诺沙星对大肠杆菌和金葡球菌的抗菌后效应

抗菌后效应(Post-antibiotic effect,PAE)是指细菌短暂接触抗菌药,当药物消除后,细菌生长仍受到持续抑制的效应。20世纪70年代中期Mcdonald、Craig和Kunin发表了有关青霉素、红霉素、万古霉素、四环