1种检测新城疫病毒的微滴式数字PCR方法

本研究旨在构建一种新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR,ddPCR）。以NDV F基因为靶基因,选取保守区域设计引物和探针,构建了NDV ddPCR。对ddPCR反应引物和探针浓度、退火温度进行了优化,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行测定。试验结果表明,ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900和250 nmol·L^-1,最佳的退火温度为55℃。ddPCR的线性良好,最低检测下限为1.8 copies·μL^-1,与禽传染性支气管炎病毒等其他6种病毒无交叉反应,样本重复的变异系数为2.4%。结果提示,本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强,可对新城疫病毒感染的临床样品进行定量检测。     

狂犬病病毒微滴式数字PCR检测方法的建立

为了建立可绝对定量狂犬病病毒(RABV)的微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本试验根据RABV基因组起始区域设计引物和探针,继而优化引物和探针浓度以及退火温度,并对建立的ddPCR方法的灵敏度、特异性和重复性进行分析。结果显示：ddPCR方法的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃;ddPCR方法的标准曲线相关系数(R²)为0.999,呈现良好的线性关系;灵敏度高,最低可检测到3.37 copies/μL;特异性良好,与常见犬病原无交叉反应;重复性好,检测结果稳定。临床样品的检测结果显示,本试验建立的狂犬病病毒ddPCR方法与实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)方法的符合率为100%。结果表明,本试验建立的狂犬病病毒微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于狂犬病病毒的绝对定量检测。     

猪瘟病毒微滴式数字PCR方法的建立

为建立猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,实现猪瘟病毒定量检测.本研究根据猪瘟病毒5'UTR基因的保守序列设计了引物探针,对反应条件进行了优化,同时对该方法的灵敏性、特异性、重复性进行了评估,并对临床样品进行了检测.结果 显示:本方法的最低检测下限为3.2 copies/μL,未发现与其他病毒有交叉反应,样本重复的变异系数为...     

布鲁氏菌种荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据荧光定量PCR原理和技术,通过与Gene Bank数据库中布鲁氏菌基因组进行序列比对,选择不同种属布鲁氏菌的特异性位点,设计3对引物和Taqman荧光探针。将3对引物进行独立的种特异荧光定量PCR实验优化,最终实现在1次荧光定量PCR反应中完成对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌的鉴别和定量。该检测方法特异、敏感、快速,既能实现对布鲁氏菌的分种,又能实现定量快速检测,对于布鲁氏菌病的流行病学调查和防治都具有重要意义。     

猪圆环病毒1型微滴数字PCR定量检测方法的建立

以猪圆环病毒1型ORF1基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法。对ddPCR反应中的探针浓度进行了优化。结果显示:ddPCR反应中的最佳探针浓度为250nmol/L;ddPCR方法线性相关系数(R2)为0.999,呈良好的线性关系;检测限为7.8copies/20μL;变异系数为2.7%;与其他病毒无交叉反应。通过对临床样品的检测,检测结果与实时荧光PCR结果一致。结果表明:新建立的ddPCR方法敏感性高、特异性强,可用于猪圆环病毒1型的定量检测。     

蜜蜂幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR检测方法的建立

为建立新型高灵敏度的幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,针对幼虫芽孢杆菌16S rRNA基因设计特异性引物和探针。通过对反应体系优化,建立幼虫芽孢杆菌ddPCR检测方法,并对方法的灵敏度、线性关系、特异性及重复性进行评估。结果:建立的方法与其他6株非幼虫芽孢杆菌无交叉反应,具有良好的特异性;线性关系良好(R^2=0. 991 4);灵敏度为2. 9 copies/μL; ddPCR检测的相对标准偏差(RSD)在0. 93%～5. 27%,重复性好。试验表明本研究建立的ddPCR方法可以对幼虫芽孢杆菌进行绝对定量检测。     

微滴式数字PCR定量检测鸡毒支原体方法的建立

为建立微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）定量检测鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）方法,以MG的mgpc基因序列为目的序列,在其保守区域内设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过各反应条件优化,建立了检测MG的ddPCR方法,并测定了建立方法的特异性、敏感性以及重复性。结果显示：建立方法的最佳引物浓度为20 μmol/μL,探针浓度为10 μmol/μL,退火温度为55 ℃;该方法只检出MG,没有检出鸡滑液囊支原体、禽衣阿华支原体、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽偏肺炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌,且相互间没有交叉反应;本方法最低检测MG重组质粒标准品的检测限为3.9拷贝/μL。重组质粒标准品浓度在3.9~41 025拷贝/μL范围内,绘制的ddPCR绝对定量曲线与测得值呈良好的线性关系（R2 = 0.999）;3次重复检测试验结果的变异系数均小于5%。对采集的60份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品进行MG检测,结果ddPCR方法的阳性检出率（15.0%）高于荧光定量PCR方法（13.3%）。结果表明,本研究建立的ddPCR方法定量检测MG特异性强,灵敏度高,重复性好,为绝对定量检测MG提供了技术手段。     

布鲁氏菌PCR快速检测方法的建立

布鲁氏菌病(简称布病)是重要的人兽共患传染病之一,它危害严重、流行广,每年因布病所造成的经济损失巨大,而且近十几年来布病又有上升的趋势.     

微滴式数字PCR定量检测禽偏肺病毒方法的建立

为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究以aMPV F基因为靶基因,根据其保守区域设计特异性引物和探针,通过各反应条件的优化,初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示,最佳引物终浓度1μmol/μL,探针终浓度0.5μmol/μL,退火温度56℃。绘制的标准曲线显示,重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R²=0.999 8)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒,结果显示,仅aMPV检测为阳性,其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(105～10⁹,4.3×10³拷贝/μL～4.3×10^-1拷贝/μL)后作为模板,采用该方法检测,结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL,比荧光定量PCR (qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品...     

单重PCR鉴别犬4种布鲁氏菌检测方法的建立

为建立适合犬布鲁氏菌病临床检测的单重PCR方法,通过对比粗糙型（犬种）与光滑型（羊种、牛种和猪种）布鲁氏菌基因组DNA的序列差异,设计1对引物并优化反应条件,建立了可初步鉴别犬4种布鲁氏菌的PCR方法,然后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对20份犬布鲁氏菌血清学阳性的血液样品进行临床检测。结果显示,利用建立的PCR反应体系对牛种、羊种和猪种布鲁氏菌均能扩增出717 bp的目的条带,对犬种布鲁氏菌能扩增出366 bp的目的条带;最低可检测到犬种、羊种、猪种和牛种布鲁氏菌基因组DNA浓度分别为5.07×10-2、6.20×10-2、7.80×10-3和5.50×10-2 ng/μL;20份血液样品中共检测到3份犬种布鲁氏菌阳性样品,与使用GB/T 18646—2018引物的PCR检测结果一致。结果表明,本试验建立的单重PCR方法简捷、特异、敏感,适合基层兽医实验室对犬布鲁氏菌病的检测与鉴定。     

A Droplet Digital PCR Method for Detection of Newcastle Disease Virus

This experiment was conducted to establish a droplet digital PCR (ddPCR) method for the detection of Newcastle disease virus (NDV). A ddPCR method was developed, which the primers and probes were designed based on the conservative regions of F gene of NDV. The concentration of primer and probe, the annealing temperature in ddPCR reaction were optimized. The sensitivity, specificity and reproducibility of ddPCR method were evaluated. In results, the optimal primer concentration and the probe concentration were 900 and 250 nmol·L^-1, the optimum annealing temperature was 55℃. The detection limit of ddPCR method was 1.8 copies·μL^-1 with a good linear response, it had no cross reaction with other six viruses (include IBV), the coefficient of variation of sample repetition was 2.4%. All the results showed that NDV ddPCR was sensitive and specific, it was suitable for quantitative detection of clinical samples infected with NDV.     

布氏杆菌微滴数字PCR方法的建立

为建立一种布氏杆菌微滴数字PCR qPCR方法,对布氏杆菌病的定量诊断提供技术支持,在实时荧光PCR (qPCR)检测方法(T/CVMA 20-2020)的基础上,建立了布氏杆菌微滴数字PCR方法,并对方法的反应条件进行了优化,同时对其敏感性、特异性、重复性进行了评估.结果 显示:本方法的最低检测下限为2.6 copi...     

实时荧光定量PCR检测布鲁菌方法的建立

旨在建立实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。经选取高度保守的具布鲁菌属特异性的BSP31基因设计了一对引物及探针,并采用矩阵法优化反应体系,筛选出引物、探针、dNTP和Mg2+最优浓度配比,同时进行了特异性和灵敏性试验,建立了实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。该方法可用于对布鲁菌病普查监测及进出境动物及其产品的检验检疫。     

小反刍兽疫病毒液滴式数字PCR检测方法的建立及应用

为实现小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的快速、准确、定量检测,以国内PPRV Clone 9疫苗株N基因为靶位点设计特异性引物及探针,建立了液滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行评价。将所建立的ddPCR方法与实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法的灵敏度进行比较分析并应用于PPRV(Clone 9株)核糖核酸标准物质的定量。结果显示,所建立的ddPCR方法特异性好,仅PPRV检测结果为阳性,其他羊源病毒类生物制品及毒种检测结果均为阴性;敏感性高,基因拷贝数检出限度为4.33拷贝/μL,比qPCR方法的灵敏度(57.3拷贝/μL)高10倍;重复性好,重复性试验的变异系数为1.8%;定量准确,具有一定资质的9家单位各组测量数据组间变异系数小于5%。试验建立的ddPCR方法能够有效地对PPRV核酸进行快速检测,为PPRV的诊断及绝对定量提供了有效方法。     

牛布氏杆菌PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31的基因序列设计特异性引物,对牛布氏杆菌样品进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为602 bp,与预期扩增序列同源性为99.7％;该PCR检测体系的特异性强,不能在非布氏杆菌 DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为0.9 pg/μL。该检测体系的成功构建为牛布氏杆菌病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

牛种布鲁杆菌PCR检测方法的研究

为了弥补血清学和微生物学方法检测和诊断布鲁菌病的种种不足,建立用布鲁菌BCSP31聚合酶链反应（PCR）快速检测布鲁菌病原的方法。根据编码牛种布鲁菌31 000外膜蛋白基因序列设计的一对特异性引物,扩增出预期350bp的基因片段。结果,此方法具有较高的特异性和敏感性,DNA最低检测量为0.42pg。结果表明,布鲁菌病原...     

鹿布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究依据布鲁氏菌的特异性基因Omp25c的部分片段作为靶基因,设计探针引物,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到PGEM-T载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线可知该方法的最低检测浓度可达到36拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。     

副鸡嗜血杆菌PCR检测方法的建立

参照GenBank中已发表的副鸡嗜血杆菌血凝素（HA）基因设计合成了一对引物,预计扩增片段大小约为412bp。利用这对引物,通过对PCR反应体系和反应条件的优化,建立了针对副鸡嗜血杆菌的PCR检测方法。结果表明,该方法敏感性较高,最低可检出1．7×10^4CFU／mL的副鸡嗜血杆菌,对副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌在相同反应条件下未扩增出任何片段,说明该方法具有较好的特异性。